小鼠足细胞的应用

背景^[1-3]

小鼠足细胞是小鼠肾小球中的一种特殊细胞，主要负责维持肾小球滤过膜的完整性和选择性通透性。

小鼠足细胞，也被称为肾小囊脏层上皮细胞，是肾小球血液滤过屏障的重要组成部分。它们附着在肾小球基底膜（GBM）的外侧，并呈星型多突状，胞体较大，有许多突起，这些突起被称为足突（FP）。相邻两个足细胞的次级突起相互交错穿插，形成栅栏状，紧贴于毛细血管基膜外面。小鼠足细胞的突起表面覆盖着一层拉链状的结构，称为裂孔膜，厚度约为4-6nm，是血浆蛋白滤液的最后屏障，也是液体进出足细胞的地方。然而，由于正常成年机体的肾脏足细胞是一种终末分化细胞，体外培养的原代细胞不能增殖，因此对小鼠足细胞的研究存在一定难度。

小鼠足细胞具有以下特点：多边形形状、多个突起、基底膜附着处有丰富的微绒毛结构。它们通过足突与周围的基底膜相连，形成一个复杂的网状结构，从而支撑肾小球的结构并调节其功能。

小鼠足细胞在肾脏疾病中扮演着重要的角色：当肾小球受损时，足细胞可能会受到损伤或死亡，导致肾小球滤过膜的破坏和蛋白尿等症状的出现；同时，足细胞也是一些自身免疫性疾病(如糖尿病肾病)的重要靶点之一。因此，对小鼠足细胞的研究对于深入了解肾脏疾病的发生机制和治疗具有重要意义。

小鼠足细胞

小鼠足细胞培养操作

1)复苏小鼠足细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)小鼠足细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3)小鼠足细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

小鼠足细胞可以用于毛蕊花糖苷通过抑制AKT/GSK-3β信号通路减轻db/db小鼠足细胞凋亡

明确毛蕊花糖苷(Acteoside,Act)对糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)的保护作用,并从足细胞凋亡及AKT/GSK-3β信号通路的角度探讨其作用机制。为寻找治疗DKD的有效药物提供了一个新的选择。

方法:本研究采用的2型糖尿病肾病动物模型为C57BLKS/J db/db小鼠,db/m小鼠(其同窝野生)为正常对照组。Act给药8周后,用相应试剂盒检测各组小鼠24小时尿蛋白定量、血肌酐、尿素氮、总胆固醇及低密度脂蛋白等指标。HE和PAS染色观察肾脏病理改变。TUNEL染色、Western Blot检测db/db小鼠肾脏足细胞损伤及凋亡情况,Western Blot检测蛋白激酶B(AKT)、糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)及凋亡相关信号蛋白等的表达。

结果:(1)Act干预后,db/db小鼠的24小时尿蛋白定量由391μg降低到152μg。

(2)Act干预可减轻db/db小鼠肾小球肥大,减少肾小球系膜细胞增生、系膜基质沉积、基底膜增厚、足细胞凋亡等病理损伤。

(3) db/db小鼠的足细胞标志物podocin及Synaptopodin表达下降,Act治疗可显著上调podocin和Synaptopodin的表达,减轻足细胞损伤。

(4)Act干预可上调db/db小鼠肾脏组织Bcl-2表达,下调Bax及cleaved caspase-3表达,抑制db/db小鼠肾脏足细胞凋亡发生。

(5)TUNEL染色结果提示db/db组小鼠肾脏组织凋亡活性较db/m增加,Act治疗可减轻其凋亡程度。(6)Act治疗可显著抑制AKT/GSK-3β信号通路的活性。结论:Act通过抑制db/db小鼠肾脏组织AKT/GSK-3β信号通路的激活,抑制db/db小鼠肾脏足细胞凋亡活性,减轻其损伤程度,从而降低db/db小鼠蛋白尿水平,发挥肾脏保护作用。

参考文献

[1]A natural product of acteoside ameliorate kidney injury in diabetes db/db mice and HK-2 cells via regulating NADPH/oxidase-TGF-β/Smad signaling pathway..Wang Qinwen;Dai Xinxin;Xiang Xiang;Xu Zhuo;Su Shulan;Wei Dandan;Zheng Tianyao;Shang ErXin;Qian Dawei;Duan JinAo.Phytotherapy research:PTR,2021

[2]Galangin attenuates oxidative stress-mediated apoptosis in high glucose-induced renal tubular epithelial cells through modulating renin–angiotensin system and PI3K/AKT/mTOR pathway.Liao Jie;Liu Bo;Chen Ke;Hu Sheng;Liu Zheng-Yu;Li Yu-Xin;Yang Zhi-Ming;Zhang Meng;Chen Xiong.Toxicology Research,2021

[3]Podocyte apoptosis in diabetic nephropathy by BASP1 activation of the p53 pathway via WT1..Zhang Yingying;Xu Chengxian;Ye Qing;Tong Lingxiao;Jiang Hong;Zhu Xiujuan;Huang Limin;Lin Weiqiang;Fu Haidong;Wang Jingjing;Persson Pontus B;Lai En Yin;Mao Jianhua.Acta physiologica(Oxford,England),2021

[4]Geniposide Improves Diabetic Nephropathy by Enhancing ULK1-Mediated Autophagy and Reducing Oxidative Stress through AMPK Activation.Dusabimana Theodomir;Park Eun Jung;Je Jihyun;Jeong Kyuho;Yun Seung Pil;Kim Hye Jung;Kim Hwajin;Park Sang Won.International Journal of Molecular Sciences,2021

[5]李小亚.毛蕊花糖苷通过抑制AKT/GSK-3β信号通路减轻db/db小鼠足细胞凋亡[D].山西医科大学,2023.