SKM-1人骨髓增生异常综合征贴壁细胞系的应用

背景^[1-3]

SKM-1人骨髓增生异常综合征贴壁细胞系是一种人类骨髓增生异常综合征的细胞系，它是由一名患有骨髓增生异常综合征的患者中分离出来的。这种细胞系在肿瘤学研究中具有重要价值，因为它可以用于评估新的治疗方法和药物的有效性，以及研究骨髓增生异常综合征的发生和发展机制。

SKM-1人骨髓增生异常综合征贴壁细胞系

SKM-1人骨髓增生异常综合征贴壁细胞系培养方法：

1、SKM-1人骨髓增生异常综合征贴壁细胞系传代：细胞密度达到80-90%时即可传代

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱消化；

③1-2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止；

④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清；

⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6-8ml培养基；

⑥悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。

2、SKM-1人骨髓增生异常综合征贴壁细胞系复苏：

①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化，时间1min左右，加入4-5ml培养基混匀。

②在1000RPM左右条件下离心4min，弃上清,加1-2ml培养基吹匀，将细胞悬液加入培养瓶中，补加适量培养基。

3、SKM-1人骨髓增生异常综合征贴壁细胞系冻存：待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）

②1-2min后，显微镜下观察细胞，大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化；

③将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清，加1ml冻存液重悬细胞；

④将冻存管放入程序降温盒，放入-80℃冰箱，4小时后将冻存管转入液氮罐储存。

应用^[4-5]

SKM-1人骨髓增生异常综合征贴壁细胞系可以用于ATPR通过上调RNA解旋酶DDX23诱导人骨髓增生异常综合征SKM-1细胞系分化的研究

选用了SKM-1人骨髓增生异常综合征贴壁细胞系进行实验,通过蛋白质组学分析基因差异表达,体外实验观察在ATPR对于ATP依赖性的RNA解旋酶DDX23表达的影响以及DDX23在ATPR诱导SKM-1细胞分化的过程中所发挥的作用。

1. ATPR对SKM-1人骨髓增生异常综合征贴壁细胞系的分化及周期影响分别通过采用在浓度不同(0、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9 M)的条件下和差异时间点(24、48、72h)作用下的ATPR对SKM-1细胞进行处理,然后使用CCK-8法检测SKM-1细胞增殖活性变化,确定ATPR对SKM-1细胞的作用条件。之后分别用western blot分析分化蛋白P27,PU.1在不同条件下的表达变化;给予ATPR(10-6 M)作用于SKM-1细胞72h后,使用流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果提示:ATPR可以在体外增加SKM-1细胞中分化蛋白的表达,其中药物在作用浓度为10-6 M,作用时间为72h时效果较为显著;同时流式结果表明ATPR可以阻滞SKM-1细胞于G1期。

2. 蛋白质组学分析ATPR作用于SKM-1人骨髓增生异常综合征贴壁细胞系的结果给予ATPR(10-6 M)作用于SKM-1细胞72h后收集细胞,通过蛋白质组学非标机定量技术(Label-Free),通过对比MS图谱,再整合到相应蛋白,实现对蛋白质在不同样本中的相对达水平的定量分析,最后分析出ATPR作用与SKM-1细胞后的蛋白表达差异情况并进行验证。结果提示:共筛选出差异大于1.2倍的上调蛋白212个以及差异小于5/6倍的下调蛋白18个,经验证结果属实,其中以ATP依赖性的RNA解旋酶DDX23在ATPR作用于SKM-1细胞时所产生的影响。

3. DDX23在ATPR诱导SKM-1人骨髓增生异常综合征贴壁细胞系分化过程中的作用将过表达质粒GV146-DDX23转染进入SKM-1细胞中,再使用ATPR(10-6 M)对转染后的SKM-1细胞进行刺激,使用western blot技术对于细胞中DDX23、P27、PU.1、PCNA、CDK4和CDK2蛋白表达量进行检测;使用瑞姬氏染色检测细胞的形态学变化;使用流式细胞仪检测细胞表面单核系分化抗原CD14的表达变化。

结果显示:过表达DDX23可以进一步促进ATPR作用后所引起的SKM-1细胞中CDK2、CDK4和PCNA的表达量下降,而PU.1和p27的蛋白表达量变化则是相反。同时过表达DDX23也可以进一步增强ATPR诱导的SKM-1细胞向成熟细胞分化的形态学改变以及SKM-1细胞表面单核系分化抗原CD14的表达。为了进一步证实DDX23的作用,我们通过使用si RNA-DDX23沉默SKM-1细胞中DDX23的表达,再使用western blot技术对于细胞中DDX23、P27、PU.1、PCNA、CDK4和CDK2蛋白表达量进行检测;使用瑞姬氏染色检测细胞的形态学变化;使用流式细胞仪检测细胞表面单核系分化抗原CD14的表达变化。

结果显示:沉默DDX23可以使SKM-1人骨髓增生异常综合征贴壁细胞系中p27、PU.1的表达量下降,同时略增了CDK2、CDK4和PCNA的表达。并且沉默DDX23会拮抗ATPR诱导的SKM-1细胞形态向成熟方向分化以及下调SKM-1细胞中表面单核系分化抗原CD14的表达。

参考文献

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[2]A novel all-trans retinoic acid derivative inhibits proliferation and induces apoptosis of myelodysplastic syndromes cell line SKM-1 cells via up-regulating p53.Yan Du;;Lan-lan Li;;Hao Chen;;Cong Wang;;Xue-wen Qian;;Yu-bin Feng;;Lei Zhang;;Fei-hu Chen.International Immunopharmacology,2018

[3]4-Amino-2-Trifluoromethyl-Phenyl Retinate induced leukemia cell differentiation by decreasing eIF6.Ke Wang;;Cong Wang;;Chuan-Jun Zhu;;Ge Li;;Yue Li;;Yu-Bin Feng;;Jing-Jing Ruan;;Fei Zhu;;Yao Meng;;Ren-Peng Zhou;;Fei-Hu Chen.Biochemical and Biophysical Research Communicatio,2018

[4]The Varied Roles of Notch in Cancer.Jon C.Aster;;Warren S.Pear;;Stephen C.Blacklow.Annual Review of Pathology:Mechanisms of Disease,2017

[5]王聪.ATPR通过上调RNA解旋酶DDX23诱导人骨髓增生异常综合征SKM-1细胞系分化的研究[D].安徽医科大学,2021.