超敏ECL发光液的应用

背景及概述^[1]

超敏ECL发光液用于Western、Northern和Southern blot分子杂交的化学发光检测，比传统化学显色法灵敏度高，可达pg水平。原理是采用新型发光底物（Luminol），其与辣根过氧化物酶反应时产生很强的发光信号，在暗室中对X-光片感光，以此检测微量蛋白而获得理想的实验结果。海基增强型ECL发光液具有灵敏度高，持续时间长等特点。

组分

组分            数量

Super ECL A       25 ml

Super ECL B       25 ml

应用^[1]

在Western 印迹分析，核酸杂交以及EMSA 实验中，HRP 标记的二抗或探针与靶分子结合再与底物反应产生可见光。蛋白印迹(western blot)分析是根据抗原、抗体特异性结合的原理检测复杂样品中某蛋白的技术。然而当样品中的蛋白浓度过低，特别是目标蛋白为低丰度蛋白时，采用普通化学发光检测，有时出现蛋白条带发光弱，曝光不够，而采用超敏ECL发光液检测则出现蛋白条带发光强，曝光过度，两者的蛋白条带显影图像均不理想。将超敏化学发光液稀释后再检测，显影效果显著提高，蛋白条带图像清晰，可见超敏化学发光液稀释法降低蛋白印迹的发光强度，提高了蛋白条带的显影效果。

储存

2-8°C，Super ECL A要求避光保存。

操作方法（以Western Blot为例)

1．按每平方厘米膜面积用0.1-0.2 ml配置发光液：根据发光液的需要量，取等体积A液和B液，混匀后避光保存备用；该发光液必须现配现用。

2. 取出膜，平放在干净的保鲜膜上，膜的正面（蛋白质面）朝上，在膜的中央加适量的配置好的发光液（6×8 cm的膜加2 ml发光液），溶液向四周迅速扩散，覆盖所有膜面。室温保温5分钟左右，在此过程中请仔细观察信号的出现。注意：如果信号强，在暗室中能很快看到阳性信号出现。

3. 待信号出现且稳定后，用镊子夹起膜，除去多余的发光液，平放在干净的保鲜膜上，膜的正面（蛋白质面）朝上，在转移膜的上面再覆盖一层保鲜膜，除去保鲜膜与转移膜之间的空气泡，请务必保证保鲜膜是干净的，不被其他杂物或液体污染。

4. 在暗室中，将膜的正面对着X-光片，放入暗盒。次曝光时间在1分钟左右(有经验的操作者可以根据信号的强弱自行决定)，立即按要求对X-光片进行显影和定影，确定曝光时间。曝光时间从数秒到数小时不等；特别弱的过夜曝光也可。

注意

1.PVDF膜较硝酸纤维膜能更好的结合蛋白，因此呈现较强的信号。选高质量的PVDF膜；尽可能不用Nylon膜。

2.与抗体结合以后，要保证膜处于湿润状态，否则会导致背景较高。

3.没有信号的原因：有些抗体不识别变性抗原，有时需要考虑电泳过程对蛋白质结构的影响；样品中无待测蛋白质或含量过低；一抗效价低，用量少，可适当增加一抗的用量；

4.背景过高原因：转移膜封闭不充分；与抗体孵育后洗涤不彻底；膜在处理过程中过干；二抗用量过多等。

5.注意及时更换显影液、定影液。

主要参考文献

[1] 范才文, 唐娟, 罗琴, 等. 超敏化学发光液稀释法降低蛋白印迹的发光强度[J]. 《 广西师范大学学报》(自然科学版), 2018, 35(2): 108-111.