TdT末端转移酶的应用

背景及概述^[1]

末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxyribonucleotidyl transferase,TdT,简称末端转移酶)，是从动物(通常是牛) 胸腺和骨髓中分离提取的。末端转移酶（TdT）是一种不依赖于模板的DNA聚合酶，催化脱氧核苷酸结合到DNA分子的3’羟基端。带有突出、凹陷或平滑末端的单双链DNA分子均可作为TdT的底物，加尾长度可达5~300nt。该末端转移酶（TdT）分子量为58.3 kDa，无5’和3’核酸外切酶活性，反应中加入Co2+可提高加尾效率。该酶广泛用于DNA的3’末端添加同聚物、利用修饰碱基（如ddNTP，DIGdUTP）标记DNA 3’末端、TdT介导的dUTP 缺口末端标记技术（细胞凋亡的原位检测）等试验。该酶经检测无DNA内切酶和外切酶污染，不含RNase。

应用^[1]

有研究应用末端脱氧核苷酰转移酶法（TdT末端转移酶法）研究抗肿瘤药物诱导人肿瘤细胞的凋亡。研究表明应用TdT法检测，在卡铂治疗的卵巢癌患者的肿瘤组织中观察到了凋亡细胞。TdT法有可能用于检测经化疗诱导的人肿瘤细胞的凋亡，以及评价治疗过程中肿瘤细胞对治疗的反应。具体应用如下：

(1)给载体或CDNA加上互补的同聚尾(用于建立体外重组DNA分子时在DNA片段末端加上一一个同聚物尾巴，两种不同的DNA分子加上不同的但可以互补的即A和T、C和G的尾巴后，经过退火或复性，两种尾巴便可以借助互补作用连接在一起)。在CDNA文库建立时，这种加尾方法是使CDNA插人载体中的常用方法之一。

(2)用于DNA片段3'末端的放射性核素标记。末端转移酶在Mg²⁺存在的条件下，选择3'-OH端单链DNA为引物加成核苷酸，在CO+存在的条件下，选择3'-OH端双链DNA为引物加成核苷酸，形成多聚核苷酸尾。如果在反应系统中加人核素标记的核苷酸，那么便可得到3'端标记的DNA分子。该法常用于核酸末端标记和核酸连接的互补多聚尾(连接头)。

活性定义

37℃60分钟内，催化1nmol dNTP加入到多聚核苷酸3’羟基末端中所需的酶量定义为1个活性单位  1×TdT Buffer    100mM KCl, 30mM Tris-acera, 0.05% (v/v) Triton X-100 (pH 7.5 at 25℃)

储存

-20℃可保存3年。

热失活

75℃20min。

注意事项

1、适量EDTA可使Terminal Transferase的活性丧失。

2、金属离子螯合剂，较高浓度的铵根离子、氯离子、碘例子和磷酸根离子均对Terminal Transferase活性具有抑制作用。

主要参考文献

[1] 童彤, 孙含笑, 刘丽影, 等. 应用末端脱氧核苷酰转移酶法研究化疗药诱导人肿瘤细胞的凋亡[D]. , 1997.