T4多聚核苷酸激酶的应用

背景及概述^[1]

T4多聚核苷酸激酶(T4 Polynucleotide Kinase，T4 PNK)，是一种多聚核苷酸5' 羟基激酶，可以催化ATP的γ位磷酸基团向单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3'磷酸基团的单核苷酸的5'羟基转移。其他NTP也可产生相同的反应：5'-OH+NTP→5'-P+NDP。上述的磷酸化反应是可逆的。当缺失ATP并且存在ADP的情况下，T4多聚核苷酸激酶可以显示出5'磷酸酯酶的活性，催化单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3'磷酸基团的单核苷酸的5'磷酸基团向ADP的转移形成ATP。其他NTP也可产生相同的反应：5'-P+NDP→ 5'-OH+NTP(最适pH为6.4左右)。当ATP和ADP都适量存在时，T4多聚核苷酸激酶可以催化单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3'磷酸基团的单核苷酸的5'磷酸基团和ATP的γ位磷酸基团之间的交换反应。

组分

应用^[1]

T4 PNK应用广泛，如寡核苷酸、DNA或RNA的5'末端标记，用作Southern、Northern、 EMSA等的探针，凝胶电泳的marker，DNA测序引物，PCR引物等；使寡核苷酸、DNA或RNA的5'端磷酸化，确保后续连接反应顺利进行；催化3'磷酸化的单核苷酸的5'磷酸化，使该单核苷酸可以和DNA或RNA的3'末端连接；去除3'端磷酸基团。

作为常用的分子生物学试剂，T4 PNK市场需求量巨大，目前基因工程技术克隆的 重组T4多聚核苷酸激酶在pET系统中表达量高，但是存在如下问题：无可溶性标签时易表达 形成包涵体，通过包涵体复性可得到少量的活性蛋白，但是保存过程中蛋白易聚集形成聚体，形成沉淀，稳定性较差；增加可溶性标签可提高可溶性蛋白的比例，但是纯化后的蛋白 活性较低，若去除标签成本较高且得到的活性蛋白稳定性较差。DNA 或 RNA 5´ 末端的磷酸化，以便进行连接反应。DNA 或 RNA 的末端标记，用作探针和进行DNA 测序；将 3´ 端已经磷酸化的单核苷酸 5´ 磷酸化，制备pNp 底物，用于添加到 DNA 或 RNA的 3´ 端；对 3´ 端有磷酸基团的寡核苷酸的 5´ 端进行标记。

活性定义

1 单位指 37℃条件下，30 分钟内催化1nmol 酸不溶性[32P] 掺入所需要的酶量。

使用注意事项^[1]

（1）1× T4 多聚核苷酸激酶反应缓冲液：70 mM Tris-HCl pH 7.6，10 mM MgCl₂，5 mM DTT，37℃ 温育。

（2）热失活：65℃ 加热 20 分钟。

（3）在放射性标记实验中，可用 1× T4 多聚核苷酸激酶反应缓冲液、50pmol的γ-[32P] ATP和20单位的酶37℃温育30分钟。

（4）T4多聚核苷酸激酶需要ATP才能发挥活性，但是为了适用于高活力的放射性标记反应，在随酶提供的反应缓冲液中不含ATP。因此在磷酸化修饰核酸时请单独添加终浓度0.5~1mM ATP。

（5）要提高平齐末端或5’凹陷末端的磷酸化效率，可在加入T4多聚核苷酸激酶前，先将DNA溶液于70℃加热5分钟，然后冰上冷却，并加入5%（W/V）的PEG-8000。

（6）一般来说，进行激酶反应之后是连接反应。在这种情况下，T4多聚核苷酸激酶反应在连接酶反应缓冲液中37℃ 温育30分钟即可。反应后的产物可直接进行连接，无需改变缓冲液和进行热失活。如果连接时需要保持其它DNA片段的去磷酸化状态，则需要在连接反应前热失活T4多聚核苷酸激酶。

主要参考文献

[1] CN201611141222.0 T4多聚核苷酸激酶重组酶及其制备方法、表达基因、表达载体以及宿主细胞