小鼠结肠癌细胞的应用

背景^[1-3]

小鼠结肠癌细胞于1995年，通过将BALB/c小鼠暴露在形成快速生长的IV级癌的N-亚硝基-N-甲基氨基甲酸酯（NMU）中而开发出来的。这些细胞具有易于植入及转移的特点。从CT26细胞系产生的克隆被命名为CT26.WT，本质上有粘附的特性并具有成纤维细胞样的形态。基因组，转录组和免疫组学研究表明CT26.WT细胞具有纯合Kras突变（p.G12D）和纯合缺失（Cdkn2a）。在该细胞中，增殖和干细胞标志物（如Top2a，Birc5，Cldn6和Mki67）高度表达，而分化和top-crypt标志物（如Muc2，Ms4a8a和Epcam）则不存在。CT26.WT细胞与侵袭性、未分化、难治性人结肠直肠癌细胞有着共同的分子特征。

小鼠结肠癌细胞

小鼠结肠癌细胞培养步骤：

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备基础培养基(GIBCO，，添加NaHCO3 1.5g/L，丙酮酸钠0.11g/L)；优质胎牛血清，10%。

2）小鼠结肠癌细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）小鼠结肠癌细胞冻存液：90%完全培养基，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

二．小鼠结肠癌细胞处理：

1）复苏小鼠结肠癌细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）小鼠结肠癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）小鼠结肠癌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%DMSO后进行冻存。

应用^[4][5]

小鼠结肠癌细胞可以用于STING信号通路对奥沙利铂抗小鼠结肠癌细胞C26的影响研究

研究STING信号通路对奥沙利铂抗小鼠结肠癌(Colorectal cancer,CRC)C26细胞体内外增殖的影响及其可能的机制。

方法1.培养C26、STING敲低表达shmSTING-C26细胞系和STING过表达的omSTING-C26细胞系,荧光显微镜下观察两组细胞的转染情况。

2. CCK8法检测常氧条件下C26、C26shmSTING和C26omSTING细胞的增殖情况,CCK8法检测在常氧与低氧条件下检测C26和C26shmSTING在不同的奥沙利铂浓度下的细胞增殖情况。

3. Western blotting法检测C26、C26shmSTING和C26omSTING细胞用奥沙利铂处理(10μg/ml)和不用奥沙利铂处理的6组细胞内的STING、TBK1、IRF3、Cyclin D1和β-actin蛋白量的表达。

4. q-PCR法检测C26、C26shmSTING和C26omSTING细胞用奥沙利铂处理和不用奥沙利铂处理的六组细胞内mSTING和mIFN-β的表达。

5. 流式细胞仪分别检测常氧与低氧(1%O2)条件下C26、C26shmSTING和C26omSTING在奥沙利铂处理下细胞周期的变化。

6. 流式细胞仪分别检测低氧条件下C26、C26shmSTING和C26omSTING在相同药物浓度情况下细胞凋亡的情况。

7. 流式细胞仪分别检测C26和C26omSTING在相同药物浓度情况下PD-L1表达的情况。

8. 将C26、C26-shmSTING和C26-omSTING细胞分别接种于Balb/c小鼠左侧腋下,观察其成瘤性及奥沙利铂给药(5 mg/kg)对移植瘤的生长抑制作用。

9. 流式细胞仪分别检测C26、C26shmSTING和C26omSTING细胞对照组和奥沙利铂给药组共6组荷瘤小鼠的瘤内的CD8+T细胞、CD107a+/CD8+T细胞和CD45+肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes,TIL)的表达。

结果1.下调C26细胞内STING刺激因子不影响细胞的增殖,上调C26细胞内STING的细胞生长增殖速度明显低于野生型C26细胞(P<0.05);在常氧和低氧条件下,奥沙利铂降低对C26-shmSTING细胞抑制率,尤其以低氧条件下更为显著。

2. 与对照组相比较,C26-omSTING细胞中STING、TBK1和IRF3表达增加,CyclinD1表达量减少;3组细胞均给予相同浓度的OXA处理后与未用OXA处理的实验组相比,STING、TBK1和IRF3表达量均增加,CyclinD1表达量减少。3.敲低和过表达STING的C26细胞给予同等浓度的OXA作用后,与各自对应的对照组相比,mSTING和mIFN-β表达量均上调。

3. 在常氧条件下C26细胞随着药物浓度的增加,对OXA的敏感性逐渐增加,而在低氧条件下,随着药物浓度的增加,对OXA的敏感性降低。在常氧和低氧条件下,随着OXA药物浓度的增加,C26-shmSTING和C26-omSTING两组细胞对奥沙利铂的敏感性逐渐增加。

4. 在低氧环境下,C26和C26-omSTING加入不同浓度的OXA培养后与实验组相比凋亡率增加。C26-shmSTING细胞加入OXA培养后与实验组相比,活细胞占有绝大比率,凋亡率随着OXA浓度的增加有轻微程度的增加。

5. 在常氧环境下,C26和C26-shmSTING细胞组在加入OXA后的PD-L1水平都是增加的,但是C26-shmSTING细胞组明显降低OXA作用下PD-L1增加的幅度。

6. C26加OXA处理组Balb/c小鼠体内成瘤与C26细胞在小鼠肿瘤的抑制率为69.98%,C26-shmSTING加OXA给药组小鼠体内肿瘤与C26-shmSTING组小鼠体内肿瘤的抑制率为27.47%;C26-omSTING加OXA给药组Balb/c小鼠体内肿瘤与C26-omSTING组小鼠体内肿瘤的抑制率为74.86%,C26-omSTING加OXA处理组小鼠体内肿瘤与C26-omSTING组小鼠体内肿瘤的抑制率为33.67%。

参考文献

[1]Pro-inflammation Associated with a Gain-of-Function Mutation(R284S)in the Innate Immune Sensor STING.Hiroyasu Konno;;Ivan K.Chinn;;Diana Hong;;Jordan S.Orange;;James R.Lupski;;Alejandra Mendoza;;Luis A.Pedroza;;Glen N.Barber.Cell Reports,2018

[2]Nontypeable Haemophilus influenzae DNA stimulates type I interferon expression via STING signaling pathway.Chang Lu;;Xuemei Zhang;;Chenyu Ma;;Wenchun Xu;;Lingling Gan;;Jin Cui;;Yibing Yin;;Hong Wang.BBA-Molecular Cell Research,2018

[3]STING signaling in tumorigenesis and cancer therapy:A friend or foe?.Liangmei He;;Xiaomei Xiao;;Xi Yang;;Zixiang Zhang;;Longhuo Wu;;Zhiping Liu.Cancer Letters,2017

[4]Biopolymers codelivering engineered T cells and STING agonists can eliminate heterogeneous tumors.Tyrel T Smith;;Howell F Moffett;;Sirkka B Stephan;;Cary F Opel;;Amy G Dumigan;;Xiuyun Jiang;;Venu G Pillarisetty;;Smitha P S Pillai;;K Dane Wittrup;;Matthias T Stephan.Journal of Clinical Investigation,2017

[5]孙智洋.STING信号通路对奥沙利铂抗小鼠结肠癌细胞C26的影响研究[D].新乡医学院,2020.