人角膜内皮细胞的应用

背景^[1-3]

人角膜内皮细胞是指人类眼球中位于角膜表面的一层细胞，具有重要的生理功能。它们可以分泌一些生物活性物质，如神经生长因子、血管生成素等，参与调节眼压、促进角膜上皮细胞的修复和再生等过程。此外，人角膜内皮细胞还被广泛应用于医学和生物学研究中，用于研究角膜疾病、药物筛选等方面。

人角膜内皮细胞

人角膜内皮细胞培养操作：

1)复苏人角膜内皮细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6 cm皿中，加入约4 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)人角膜内皮细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.02%EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1-3min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)人角膜内皮细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

人角膜内皮细胞可以用于LIF-JAK1-STAT3信号通路延迟人角膜内皮细胞接触抑制作用机制研究

探究人角膜内皮细胞在改良胚胎干细胞培养基体外培养中能持续增殖并延迟接触抑制的相关机制。

方法：通过比较人角膜内皮单层细胞在SHEM,ESCM,ESCM+LIF,ESCM+bFGF和MESCM等不同培养基中培养第7,21,35和42天后5-溴脱氧尿嘧啶核苷染色情况来判断人角膜内皮细胞在不同环境下的增殖能力。并通过qRT-PCR检测和定量分析胚胎干细胞标志物,神经嵴细胞标志物,骨形成蛋白配体和受体以及细胞周期相关基因的表达情况。通过共聚焦荧光染色显微镜等技术观察相关信号通路关键蛋白在细胞不同部位的表达情况,从而明确人角膜内皮细胞延迟接触抑制的相关信号通路机制。

结果：人角膜内皮细胞在SHEM培养基中第21天时5-溴脱氧尿嘧啶核苷染色阴性,而在ESCM+LIF和MESCM中第35天时仍染色阳性。另外,在ESCM中添加白血病抑制因子(LIF,leukemia inhibitory factor)不仅和MESCM一样可以明显增加其中7种胚胎干细胞和神经嵴细胞标志物的表达,还可以明显增加Oct4,Rexl和SSEA4等胚胎干细胞标志物的表达。

在ESCM中单独或同时添加LIF和bFGF都不足以激活经典或非经典的BMP信号通路。进一步分析发现磷酸化的STAT3核转位只有在包含LIF的培养基中才存在,提示LIF激活了培养的人角膜内皮细胞中的LIF-JAK1-STAT3信号通路。第35天时通过JAK1和STAT3siRNA的基因敲减技术处理可以消除人角膜内皮细胞在LIF包含的培养基中阳性的5-溴脱氧尿嘧啶核苷染色和G1/S细胞周期相关基因p-Rb等的核转位,进一步证实延迟人角膜内皮细胞的接触抑制确实受LIF-JAK1-STAT3信号通路的调控。

结论：和SHEM相比,MESCM培养基可以通过延迟人角膜内皮细胞接触抑制的重建促进角膜内皮细胞的体外增殖生长。其中LIF而不是bFGF可以激活LIF-JAK1-STAT3信号通路并通过促进G1/s细胞周期正向基因的表达,从而达到延迟人角膜内皮细胞接触抑制的作用。

参考文献

[1]JAK-STAT3 and somatic cell reprogramming.Yong Tang;;Xiuchun(Cindy)Tian.JAK-STAT,2013

[2]Nuclear p120 catenin unlocks mitotic block of contact-inhibited human corneal endothelial monolayers without disrupting adherent junctions.Ying-Ting Zhu;;Hung-Chi Chen;;Szu-Yu Chen;;Scheffer C.G.Tseng.Journal of Cell Science,2012

[3]Proliferative capacity of corneal endothelial cells.Nancy C.Joyce.Experimental Eye Research,2011

[4]Methods being developed for preparation,delivery and transplantation of a tissue-engineered corneal endothelium.Stéphanie Proulx;;Isabelle Brunette.Experimental Eye Research,2011

[5]刘欣.LIF-JAK1-STAT3信号通路延迟人角膜内皮细胞接触抑制作用机制研究[D].华中科技大学,2016.