小鼠海绵体平滑肌细胞的应用

背景^[1-3]

小鼠海绵体平滑肌细胞分离自海绵体组织采用胰蛋白酶-胶原酶联合消化法结合差速贴壁法制备而来。海绵体平滑肌细胞不仅含有丰富的肾上腺素能受体、胆碱能受体，而且还含有多种其他能受体，作为勃起组织中最主要的舒收缩成分，是组成阴茎勃起功能的主要承担着。在病理条件下，阴茎勃起组织中海绵体平滑肌细胞减少与勃起功能障碍的发生关系密切，且与临床表现的严重程度一致。

小鼠海绵体平滑肌细胞

小鼠海绵体平滑肌细胞操作规程:

一.培养基及培养冻存条件准备:

1)准备RPMI-1640培养基(RPMI-1640:GIBCO),90%;优质胎牛血清,10%。

2)小鼠海绵体平滑肌细胞培养条件:气相:空气,95%;二氧化碳,5%。温度:37℃,培养箱湿度为70%-80%。

3)小鼠海绵体平滑肌细胞冻存液:90%血清,10%DMSO,现用现配,液氮储存。

二．小鼠海绵体平滑肌细胞处理：

1）复苏小鼠海绵体平滑肌细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）小鼠海绵体平滑肌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）小鼠海绵体平滑肌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%DMSO后进行冻存。

应用^[4][5]

小鼠海绵体平滑肌细胞可以用于携带siRNA的慢病毒载体抑制SHR阴茎海绵体平滑肌细胞S1PR3的表达

筛选出能够高效特异性沉默自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)阴茎海绵体平滑肌细胞1-磷酸鞘氨醇受体3(sphingosine-1-phosphate receptor 3,S1PR3)基因表达的siRNA慢病毒载体,并观察其对SHR阴茎海绵体平滑肌细胞ROCK1、ROCK2、eNOS表达的影响。

方法:以大鼠S1PR3基因mRNA序列作为干扰靶点,设计并合成3对靶向S1PR3的siRNA序列(siRNA1、siRNA2、siRNA3)及1对阴性对照序列,构建并包装成慢病毒载体。

体外培养SHR阴茎海绵体平滑肌细胞及魏-凯二氏大鼠(Wistar-Kyoto rats,WKY)阴茎海绵体平滑肌细胞,随机分为A组(SHR对照组)、B组(携带阴性对照病毒的SHR阴茎海绵体平滑肌细胞转染组)、CE组(分别携带靶向S1PR3基因siRNA13号靶点慢病毒的SHR阴茎海绵体平滑肌细胞转染组)、F组(WKY对照组),以感染复数(MOI)=60转染SHR阴茎海绵体平滑肌细胞,转染72h后观察细胞绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达情况,并用RT-PCR和Western blotting检测转染后细胞中S1PR3、ROCK1、ROCK2、eNOS mRNA及蛋白的表达情况。

结果:经基因测序证明合成的携带S1PR3基因siRNA 13号靶点的寡核苷酸链序列插入正确。荧光显微镜下观察发现携带靶向S1PR3的siRNA慢病毒载体及阴性对照病毒载体均能有效转染SHRCCSM细胞,且转染效率均>80%。

C、D、E、F组的S1PR3、ROCK1、ROCK2 mRNA及蛋白的表达较A组下降(p<0.05),其中E组抑制作用最为明显,使S1PR3基因mRNA及蛋白表达的抑制效率分别为(34.2±2.9)%、(77.7±4.7)%;ROCK1基因mRNA及蛋白表达的抑制效率分别为(33.3±1.4)%、(51.1±7.3)%;ROCK2基因mRNA及蛋白表达的抑制效率分别为(30.8±3.6)%、(58.32±5.5)%。S1PR3、ROCK1、ROCK2 mRNA及蛋白的表达在A组与B组之间均无明显改变,A组eNOS基因mRNA及蛋白表达分别与B、C、D、E比较,无明显差别,但较F组显著降低(p<0.01);与F组比较,E组S1PR3、ROCK1、ROCK2 mRNA及蛋白的表达均无明显差别,A、B、C、D组的S1PR3、ROCK1、ROCK2基因mRNA及蛋白表达高于F组(p<0.05),A、B、C、D、E组eNOS基因mRNA及蛋白表达较F组显著降低(p<0.01)。

结论:本研究构建的3条携带不同位点的S1PR3基因的siRNA慢病毒载体均能够显著抑制SHR阴茎海绵体平滑肌细胞S1PR3基因的表达,并能有效的抑制SHR阴茎海绵体平滑肌细胞中上调的RhoA/Rho激酶信号通路,其中携带siRNA3慢病毒载体的抑制效率最高。

参考文献

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[2]Endothelial Dysfunction and the Effects of TNF Inhibitors on the Endothelium in Psoriasis and Psoriatic Arthritis:A Systematic Review.Elizabeth A.Brezinski;;Matthew R.Follansbee;;Ehrin J.Armstrong;;April W.Armstrong.Current Pharmaceutical Design,2014

[3]Expression of Sphingosine 1-Phosphate 1-3 on Penile Cavernous Tissue in Hypertensive and Normotensive Rats.Boyi Wang;;Jun Jiang;;Zhongcai Fan;;Rui Jiang;;Run Wang;;Haocheng Lin.Urology,2014

[4]Psoriasis prevalence among adults in the United States.Tara D.Rachakonda;;Clayton W.Schupp;;April W.Armstrong.Journal of the American Academy of Dermatology,2014

[5]吴邦财.携带siRNA的慢病毒载体抑制SHR阴茎海绵体平滑肌细胞S1PR3的表达[D].西南医科大学,2018.