狗源单克隆抗体制备

背景^[1-5]

狗源单克隆抗体制备是基于在噬菌体展示抗体库构建和筛选技术，并为客户成功筛选到了大量高亲和力的抗体。采用这种技术，已经为来自动物医学界的科学家们生产了大量用于治疗或预防犬类恶性、慢性、感染性或者自身免疫性疾病的抗体，促进了犬类药物的开发。当客户的抗原不适合用于动物免疫时，也可进行合成抗体库定制服务。通过对狗抗体的６个CDR区（或者两个CDR3区）引入突变的形式，构建突变库或者变异库。通过综合采用多种突变策略，可以生产针对任意抗原的抗体，包括那些毒性抗原或者对动物无免疫反应的抗原。

噬菌体展示技术：

噬菌体展示技术是复制生物的某单一性状多样性和选择单一筛选压力进行相互作用，有目的的获得能够适应该筛选压力的性状的技术。具体到噬菌体抗体展示技术，通常是通过大肠杆菌丝状噬菌体M13的基因工程改造复制生物的抗体的遗传基因的多样性，并将基因编码的抗体和噬菌体的膜蛋白融合展示在噬菌体表面，选择是否能够和某个特定的靶点蛋白结合作为筛选压力，有目的的得到能够和该特定靶点蛋白结合的抗体及其遗传信息的技术。

噬菌体抗体展示技术突破性贡献在于建立体外抗体功能和其对应的遗传信息的直接联系，筛选到有功能的抗体的噬菌体的同时也就得到了该噬菌体内蕴含编码抗体对应的遗传信息。

噬菌体展示技术优势：

噬菌体展示技术不论是作为抗体发现的源头技术，还是作为抗体工程中抗体特性改造中的筛选工具都有着现有传统技术无可替代的优势和多方向领域的应用。

1.相对于传统的鼠免疫杂交瘤技术，采用人的天然噬菌体文库筛选出来的抗体是全人的，能够有效的降低免疫原性的风险，这个在需要长期定期注射给药的慢性病如类风湿疾病治疗中是十分关键的一个因素。

2.相对于转基因小鼠进行全人抗体的发现，需要体内免疫小鼠，一些人鼠同源性较高保守的蛋白，毒性较大的蛋白如针对炭疽毒素的上市抗体Raxibacumab，抗原不稳定的蛋白，有变构的蛋白以及多透膜的蛋白并不适用于体内筛选，人的噬菌体文库为体外筛选的模式能够进行更多靶点分子的抗体发现。而且噬菌体展示技术未经过体内免疫的过程，能够对单个靶点多表位（尤其是人鼠同源性较高的保守表位）的抗体发现。

3.相对基于免疫的体内抗体发现技术，动物免疫，后期的杂交瘤融合，单克隆筛选等繁琐细胞培养过程，噬菌体展示其淘选，筛选过程在大肠杆菌中进行，扩增过程非常简单，抗体发现的时间周期短，实验出现意外的风险低，试剂耗材和人力成本更低。

4.免疫后的动物能够抽取其B细胞进行免疫噬菌体文库的建立，综合体内免疫和噬菌体体外筛选的两方面优势。如个上市纳米抗体Caplacizumab是免疫羊驼然后利用噬菌体文库技术筛选出来的，此方法在科研用的工具抗体筛选和发现中有极大的作用。

5.对现有的抗体的基因序列进行随机或者定点突变构建突变文库，进行人源化或者亲和力成熟，筛选出亲和力更强的抗体或者条件激活抗体等，如Genetech的Ranibizumab和Bevacizuma上市抗体都是源于鼠克隆单抗体A4.6.1，Bevacizuma抗体的人源化是将CDR区移植到人的框架区(VLκ1,VHIII)然后经过定点突变得到的，而Ranibizumab的人源化是将CDR区域移植在不同的人的轻重链框架区构建噬菌体文库筛选得到的高亲和力抗体2。

6.以现有的抗体为导标（Guided selection），利用天然噬菌体文库筛选出与该抗体作用于靶点一样表位的多个新序列抗体，能够取得和导标抗体体内药效一致的新序列抗体，如阿达木是以鼠单抗MAK195为导标，利用噬菌体展示，通过Guided selection筛选得到的3。

7.挑选抗体轻重链框架区相对固定的组合构建CDR区多样的合成的噬菌体文库，轻重链框架区相对固定的组合移除了潜在的翻译后修饰位点（PTMs），使得筛选出来的抗体均有较好的理化特性，降低后期CMC的难度。如MorphoSys的Ylanthia合成噬菌体文库4。

8.嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法的CAR通常是scFv，这个和噬菌体展示的scFv文库有相似的展示环境，利用噬菌体展示技术寻找CART中的CAR（嵌合抗原受体）是创新CAR-T疗法的关键5。

9.噬菌体展示多肽的技术在药物研发领域也有十分广泛的应用

应用^[6][7]

狗源单克隆抗体制备可用于犬细小病毒单克隆抗体的制备服务：

犬细小病毒(Canine Parvovirus,CPV)引起的急性出血性胃肠炎和心肌炎是近年来发现的一种犬烈性传染病,主要危害幼犬,特别是2～6月龄幼犬,发病率和死亡率均很高。幼犬在初次感染病毒后由于机体免疫系统发育还不够完善，所以需要人工注射犬细小病毒单克隆抗体以中和病毒。

参考文献

[1]Differences in the Evolutionary Pattern of Feline Panleukopenia Virus and Canine Parvovirus[J].Motohiro Horiuchi,Yumi Yamaguchi,Takashi Gojobori,Masami Mochizuki,Hideyuki Nagasawa,Yutaka Toyoda,Naotaka Ishiguro,Morikazu Shinagawa.Virology.1998(2)

[2]Evolution of Canine Parvovirus Involved Loss and Gain of Feline Host Range[J].UWE TRUYEN,JAMES F.EVERMANN,ELKE VIELER,COLIN R.PARRISH.Virology.1996(2)

[3]Analysis of the Cell and Erythrocyte Binding Activities of the Dimple and Canyon Regions of the Canine Parvovirus Capsid[J].Dina B.Tresnan,Laurel Southard,Wendy Weichert,Jean-Yves Sgro,Colin R.Parrish.Virology.1995(1)

[4]Feline host rangeof canine parvovirus:recent emergence of new antigenictypes in cats.Ikeda Y,Nakamura K,Miyazawa T,et al.Journal of Virology.2004

[5]Canine parvovirus(CPV)vaecination:Comparison of neutralizing antibody responses in pups after inoculation with CPV2 or CPV2b modified live virus vaceine.Pratelli A,Cavalli A,Martella V,et al.Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology.2001

[6]文翼平,李英伦,文心田.犬细小病毒单克隆抗体对犬细小病毒病的临床应用研究[J].中国兽医学报,2011,31(11):1564-1567.

[7]杨振宇.犬细小病毒单克隆抗体的制备和初步应用[D].扬州大学,2007.