LMH 鸡肝癌细胞系的应用

背景^[1-3]

LMH鸡肝癌细胞系是于1981年由Tomoyuki Kitagawa在日本东京都渡岛区Kami Ikebukuro癌症研究所建立的一种原发性肝细胞癌上皮细胞系。该细胞系癌组织来源于通过二乙基亚硝胺的长期治疗的Leghorn鸡肝脏中诱发的肿瘤结节。LMH细胞表达葡萄糖-6-磷酸酶和微弱的微观ATP酶活性，含有低水平的功能性雌激素受体，可诱导肝脏特异性载脂蛋白II（apoII）基因的表达。LMH细胞可以用于3D细胞培养和癌症研究。

LMH鸡肝癌细胞系

LMH鸡肝癌细胞系培养操作

1）复苏LMH鸡肝癌细胞系细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）LMH鸡肝癌细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）LMH鸡肝癌细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

1.细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

LMH鸡肝癌细胞系可以用于禽腺病毒4型弱毒株ON1的生物学特性及其免疫效力初步评价

为了研发用于HHS防控的FAdV-4弱毒活疫苗,本研究对分离自健康鸡的FAdV-4毒株ON1的生物学特性和体外增殖规律以及对FAdV-4中国流行株强毒攻击的保护效果进行了研究,以期为进一步研发用于防控HHS的弱毒活疫苗奠定基础。

研究内容包括以下2个方面:1.FAdV-4弱毒株ON1的生物学特性研究为了解FAdV-4毒株ON1的生物学特性,利用SYBR Green I实时荧光定量PCR和病毒滴度测定方法,研究该毒株在LMH鸡肝癌细胞系中的生长特性和增殖规律。

结果显示FAdV-4毒株ON1在LMH中能够很好增殖,呈现典型的腺病毒感染细胞病变,不同时间点的病毒滴度与病毒基因组拷贝数呈正相关,病毒感染后72 h时滴度最高,且培养上清中亦含有大量成熟的病毒粒子;将FAdV-4毒株ON1经口感染7日龄SPF鸡,所有感染鸡临床没有任何症状;ON1感染鸡在感染后12小时可从泄殖腔分离出病毒,2周的观察期内可持续检测到排毒;采集感染鸡的组织器官制备病理切片进行HE染色,结果显示ON1感染鸡各组织器官与未感染对照鸡没有明显差异。证明毒株ON1临床上对鸡不具有致病性。

2. FAdV-4弱毒株ON1的免疫原性和免疫效力为评价FAdV-4毒株ON1的免疫原性,本试验利用LMH鸡肝癌细胞系培养FAdV-4毒株ON1,将60只7日龄SPF鸡随机分为两组,经口服感染FAdV-4 ON1毒株,免疫后在不同时间点检测ON1毒株免疫鸡的FAdV-4特异性抗体水平,分析其免疫原性,同时采集泄殖腔拭子检测免疫鸡的排毒情况。

结果显示,ON1免疫鸡均产生FAdV-4特异性抗体和中和抗体,抗体水平在免疫后2周达到高峰期,并维持较长时间。ON1免疫鸡在感染后2周的观察期内持续排毒,病毒的排毒持续期与诱导的抗体水平相一致。在免疫后2周使用FAdV-4中国流行强毒株攻毒,以评价弱毒疫苗的免疫效力。

结果显示,ON1免疫后2周用FAdV-4中国流行株强毒株攻毒,ON1免疫可以对FAdV-4中国流行强毒株提供75%保护,而对照组鸡全部死亡。结果表明FAdV-4 ON1毒株免疫可以对FAdV-4中国流行强毒株的攻击提供部分保护作用。

参考文献

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[2]Comparison of fiber gene sequences of inclusion body hepatitis(IBH)and non-IBH strains of serotype 8 and 11 fowl adenoviruses.Helena Grgi?;;Peter J.Krell;;éva Nagy.Virus Genes,2014

[3]Characterization of fowl adenoviruses associated with hydropericardium syndrome and inclusion body hepatitis in broiler chickens.Dinesh Mittal;;Naresh Jindal;;Ashok Kumar Tiwari;;Raj Singh Khokhar.Indian Journal of Virology,2014

[4]Hydropericardium syndrome:current state and future developments.Manu Asthana;;Rajesh Chandra;;Rajesh Kumar.Archives of Virology,2013

[5]张凤丽.禽腺病毒4型弱毒株ON1的生物学特性及其免疫效力初步评价[D].河南农业大学,2019.