TB 1 LU 蝙蝠肺细胞系的应用

背景^[1-3]

TB 1 LU蝙蝠肺细胞系是蝙蝠肺细胞系，常用于病毒研究。这种细胞系是分离于中国南方一种蝙蝠的肺部组织。

肺是机体的呼吸器官，位于胸腔，左右各一，覆盖于心之上。肺有分叶，左二右三，共五叶。肺经肺系（指气管、支气管等）与喉、鼻相连，故称喉为肺之门户，鼻为肺之外窍。肺泡由单层上皮细胞构成的半球状囊泡。肺中的支气管经多次反复分枝成无数细支气管，它们的末端膨大成囊，囊的四周有很多突出的小囊泡，即为肺泡。

TB 1 LU蝙蝠肺细胞系

TB 1 LU蝙蝠肺细胞系细胞复苏操作步骤：

1．将冷冻管迅速由液氮转入到37℃水浴中，冷冻管的顶部保持在水面以上以避免任何污染，不定时搅拌加速解冻；

2．当细胞完全解冻后，用含70%乙醇的纱布擦拭冷冻管消毒；

3．将解冻后细胞转移到含4℃预平衡培养液的试管中；

4．细胞悬液在4℃下200磄离心10分钟；

5．弃上清，将细胞重新悬浮在新鲜培养液中；

6．将细胞转移到细胞培养瓶，CO2孵箱中培养；

7．是用倒置显微镜检查细胞存活率以及细胞密度，如果细胞密度过高，用培养液稀释至适宜浓度。

收到TB 1 LU蝙蝠肺细胞系细胞后，取出培养瓶在倒置显微镜下观察细胞生长情况。

（一）如果细胞未长满，用75%酒精喷洒整个瓶消毒后放到超菌台内，严格无菌操作，打开细胞培养瓶，吸出培养液，仅留下10ml培养液在瓶内继续培养。

（二）如果细胞已长满，即可进行传代培养。具体步骤如下：

1.弃去培养液，用PBS（不含钙，镁离子）洗1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，倒转放于37度培养箱1-3分钟预热，然后又将培养瓶倒转大约30秒后，在倒置显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆分散，轻敲几下培养培养瓶，细胞随即脱落下来。

3.加入6-8ml完全培养基，吸出，分到新的培养瓶中。1:3~1:6传代；2~3天1次。

应用^[4-5]

TB 1 LU蝙蝠肺细胞系可以用于牛白血病病毒流行病学调查、分离培养及其对奶牛乳腺上皮细胞增殖和凋亡的影响

利用分子流行病学调查,首次在宁夏回族自治区发现我国存在BLV基因4型毒株;利用TB 1 LU蝙蝠肺细胞系,成功分离鉴定了我国的BLV流行毒株;进一步,通过体外试验探究了BLV感染对奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)增殖和凋亡的调控作用。

具体研究如下:1.我国BLV流行病学调查基于env基因的遗传多态性,BLV被划分为11个基因型,即基因1型一基因11型。本研究在宁夏回族自治区的石嘴山、银川、吴忠、中卫等4个市采集了219头奶牛的全血样品,运用本实验室建立的FRET-qPCR方法对样品进行检测,结果表明,上述地区BLV的总体阳性率为18.26%(40/219),其中石嘴山、银川、吴忠、中卫4个市的阳性率分别为17.31%(9/52)、23.33%(21/90)、10.34%(6/58)、21.05%(4/19)。运用临接法(Neighbor-joining,NJ)分析发现,阳性样品属于BLV基因4型和6型。与GenBank收录的代表BLV不同基因型的参考序列比较,结果发现本研究鉴定的毒株env基因共存在23处突变,其中9处为非同义突变,包括糖蛋白51(gp51)的6处突变和糖蛋白30(gp30)的3处突变。本研究首次在国内发现了BLV基因4型毒株,并分析了其env基因的遗传多样性,相关突变是否对病毒致病性造成影响还需进一步的研究。

2. 体外BLV分离培养纯化BLV的分离培养需要借助敏感细胞系—胎羊肾细胞系(fetal lamb kidney cell line,FLK),但该细胞在国内难以获得,导致国内科学家难以开展BLV的病原学、致病性、疫苗研制等相关研究。

3. 本研究通过FRET-qPCR方法检测和筛选了高病毒滴度的奶牛(编号:17985),并将其外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)分别与TB 1 LU蝙蝠肺细胞系、奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)、牛肾细胞(MDBK)进行共培养并连续传代,同时通过FRET-qPCR和间接免疫荧光实验(indirect immunoinfluscentassay,IFA)检测各组细胞的感染情况。

FRET-qPCR结果显示,在感染初期,Tb 1 Lu-BLV、MAC-T-BLV、MDBK-BLV的拷贝数分别为1,723.328拷贝/反应、94.528拷贝/反应、0.169拷贝/反应;在连续11次传代后,拷贝数分别为4,407.497拷贝/反应、19.460拷贝/反应、1.765拷贝/反应。IFA结果显示,Tb 1 Lu-BLV特异性荧光随连续传代逐渐增多,并在连续13次传代后达到稳定感染状态;而其余两种细胞经过11次连续传代后未观察到特异性荧光。因此本研究利用敏感细胞系Tb 1 Lu成功完成了我国BLV流行毒株基因6型的分离纯化,有助于后续BLV病原学和疫苗研制等工作的开展。

参考文献

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[2]Molecular Characterization of the env Gene of Bovine Leukemia Virus in Cattle from Pakistan with NGS-Based Evidence of Virus Heterogeneity.RolaŁuszczak Marzena;Sakhawat Ali;Pluta Aneta;Ryło Anna;Bomba Arkadiusz;Bibi Nazia;Kuźmak Jacek.Pathogens,2021

[3]Invited review:Bovine leukemia virus—Transmission,control,and eradication.Kuczewski Alessa;Orsel Karin;Barkema Herman W.;Mason Steve;Erskine Ron;van der Meer Frank.Journal of Dairy Science,2021

[4]Risk factor for breast cancer development under exposure to bovine leukemia virus in Colombian women:A case-control study..OlayaGalán Nury N;SalasCárdenas Sandra P;RodriguezSarmiento Jorge L;IbáñezPinilla Milcíades;Monroy Ricardo;CorredorFigueroa Adriana P;Rubiano Wilson;de la Peña Jairo;Shen HuaMin;Buehring Gertrude C;Patarroyo Manuel A;Gutierrez Maria F.PloS one,2021

[5]宫再成.牛白血病病毒流行病学调查、分离培养及其对奶牛乳腺上皮细胞增殖和凋亡的影响[D].扬州大学,2023.