猫疱疹病毒PCR试剂盒的应用

背景^[1-3]

猫疱疹病毒PCR试剂盒是在PCR反应中利用标记荧光染料的基因特异寡核苷酸探针来检测产物；而非特异性检测方法是在在PCR反应体系中，加入过量荧光染料，荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射出荧光信号。

猫疱疹病毒又称为病毒性鼻支气管炎,广泛存在于全世界,并且只有一种血清型被确认而已,但其毒力在各病毒株之间各有不同。猫的疱疹病毒会在结膜及上呼道上皮细胞内复制增殖,也会在神经元细胞内复制增殖,神经原的感染会导致终身潜伏感染,虽然猫的疱疹病毒与犬的疱疹病毒有抗原相关性,但尚不知是否会互相传染。

猫疱疹病毒PCR试剂盒使用方法

一、稀释猫疱疹病毒PCR试剂盒PCR阳性对照（以10E2-10E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）

1.注意：由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的DNA片段作为阳性对照。

2.标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。

3.用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液（用带芯枪头，下同）。

4.在7号管中加入5μL 1×10E8拷贝/μL的阳性对照，充分震荡1分钟，得1×10E7拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

5.换枪头，在6号管中加入5μL 1×10E7拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

6.换枪头，在5号管中加入5μL 1×10E6拷贝/μL的阳性对照到5号管中，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

7.TUNEology波长可调检测卡盒-->

应用^[4-5]

猫疱疹病毒PCR试剂盒可以用于猫细小病毒与疱疹病毒1型双重qPCR及MAOPA检测方法的建立与应用

同时建立了猫细小病毒、猫疱疹病毒双重q PCR及MAOPA(Magnetic beads mediated All-in-One Polymerase Amplification,MA OPA)检测方法,并分别对两种方法进行了初步临床应用,评估了两种方法的特异性、灵敏度和重复性。建立同时检测FPV和FHV-1的双重qPCR方法,针对FPV的VP2基因、FHV-1的UL21基因设计特异性引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了双重标准曲线,其相关系数(R2)FPV为0.997,FHV-1为0.998,均具有良好的线性关系。结果显示,FPV、FHV-1最低检测限分别为4.87×103和2.21×103copies/mL;且对猫的常见病毒病及细菌病无非特异反应;组内组间变异系数均小于2%。

证明该方法灵敏度高、特异性强、重复性好,表明本方法可应用于FPV、FHV-1感染的早期诊断、定量检测和流行病学调查等。建立同时检测FPV和FHV-1的双重MAOPA检测方法,在章的基础上针对GAPDH保守序列设计特异性引物探针,构建包含内标基因重组质粒,成功构建DH5α-pMD18T-FPV-VP2、DH5α-pMD18T-FHV-1-UL21、DH5α-pMD18T-GAPDH菌种库,测试筛选出内标的引物探针组合以及反应条件,并选择DH5α-pMD18T-GAP DH菌液的106稀释倍数浓度作为MAOPA检测方法的质控内标,建立了猫细小病毒、猫疱疹病毒双重MAOPA检测方法并进行卡盒的组装。

对卡盒的特异性、灵敏度和重复性进行测试分析,靶向FPV、FHV-1的最低检测量分别为4.37×102 copies/mL和3.72×102 copies/mL;且对猫的常见病毒病及细菌病无非特异反应;组内组间变异系数均小于2%。

以上证明猫细小病毒、猫疱疹病毒双重MAOPA卡盒灵敏度高、特异性强、重复性好,全流程内标质控的反应不存在假阴性结果,适用于FPV、FHV-1感染的早期诊断、鉴别与流行病学调查。对2019-2022年于全国多地收集的845份临床样品,经实验室初步检测后,利用本研究建立猫细小病毒、猫疱疹病毒双重qPCR检测方法、MAOPA卡盒进行符合率、敏感性和重复性试验,其中FPV的阳性检出率高于FHV-1,双重qPCR检测方法检出FPV阳性560份,阳性率为66.27%(560/845),MAOPA卡盒检出FPV阳性566份,阳性率为66.98%(566/845);双重qPCR方法检出FHV-1阳性165份,阳性率为19.52%(165/845),MAOPA卡盒检出FHV-1阳性172份,阳性率为20.35%(172/845),两种方法检测出混合感染均为136份,混感率为16.09%(136/845)。

分别计算两种检测方法与已知结果的符合率,双重qPCR方法检测FPV阳性符合率为100%,阴性符合率为96.6%,总符合率为98.8%;FHV-1的阳性符合率为100%,阴性符合率为99.3%,总符合率为99.4%。MAOPA卡盒检测FPV阳性符合率为100%,阴性符合率为94.6%,总符合率为98.1%;FHV-1的阳性符合率为100%,阴性符合率为98.2%,总符合率为98.6%。

参考文献

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[2]Molecular and serological investigation of cat viral infectious diseases in China from 2016 to 2019..Liu Caihong;;Liu Yuxiu;;Qian Peng;;Cao Yujiao;;Wang Jie;;Sun ChunYan;;Huang Baicheng;;Cui Ningning;;Huo Ningning;;Wu Hongchao;;Wang Lingxiao;;Xi Xiangfeng;;Tian Kegong.Transboundary and emerging diseases,2020

[3]Prevalence of serum antibody titres against feline panleukopenia,herpesvirus and calicivirus infections in stray cats of Milan,Italy.Paola Dall’Ara;;Chiara Labriola;;Elisabetta Sala;;Eva Spada;;Sonia Magistrelli;;Stefania Lauzi.Preventive Veterinary Medicine,2019

[4]Fulminant Tritrichomonas foetus‘feline genotype’infection in a 3-month old kitten associated with viral co-infection.Laura Setyo;;Shannon L.Donahoe;;Jan?lapeta.Veterinary Parasitology,2018

[5]于孔森.猫细小病毒与疱疹病毒1型双重qPCR及MAOPA检测方法的建立与应用[D].扬州大学,2023.