MCF-7B 人乳腺癌细胞系的应用

背景^[1-3]

MCF-7B人乳腺癌细胞系是从一名69岁白人女性乳腺癌患者的胸腔积液中分离建立，常用于乳腺癌发病机理的研究。MCF-7B人乳腺癌细胞系来源于MCF-7细胞的一个亚克隆，表达高水平的褪黑素MT1受体的mRNA，对褪黑素有一定的敏感性。

MCF-7B人乳腺癌细胞系

人乳腺癌细胞系是用于研究乳腺癌的重要工具之一。通过研究这些细胞系，科学家们可以更好地了解乳腺癌的生物学特性、治疗靶点以及药物敏感性等方面的信息。MCF-7细胞系是其中一种广泛使用的细胞系，而MCF-7B则是从MCF-7细胞系中获得的一个亚克隆。MCF-7B人MCF-7B人乳腺癌细胞系属于贴壁细胞，显微镜下呈现上皮细胞形态，且保留了多个分化乳腺上皮的特性，

包括：1）能通过胞质雌激素受体加工雌二醇并能形成隆突结构（domes）；

2）能表达WNT7B癌基因；

3）肿瘤坏死因子α（TNF alpha）可以抑制MCF-7B人乳腺癌细胞系细胞生长；

4）细胞经抗雌激素处理能调节胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBP）的分泌。

MCF-7B人乳腺癌细胞系细胞常用DMEM培养基，含10%胎牛血清，在37度、5%CO2培养箱中培养。MCF-7B人乳腺癌细胞系复苏后贴壁相对较慢，每周2-3次更换新鲜培养基，按1:2至1:3比例传代，胰酶消化室温1-2分钟，细胞培养时可添加0.01mg/mL胰岛素，需要注意的是MCF-7生长较快，如不及时传代可出现整瓶细胞漂浮。

MCF-7B人乳腺癌细胞系细胞培养特点

1.MCF-7细胞一般情况下是生长缓慢的细胞系，前期呈岛状生长，随着细胞生长，细胞会逐步变成扁平单层细胞。通常需要6~12天才能达到80%生长密度，如果生长速度比正常情况还要缓慢，可能需要换另外批次的血清，把血清浓度提高到20%也有助于改善细胞生长情况。

2.细胞在复苏和传代后，会在培养基中观察到成团的细胞漂浮物，对于这个细胞来说这是正常的情况，在复苏和传代后前三天可以静置细胞不做处理，三天后贴壁情况会有所改善，但悬浮的细胞团仍会出现，这些悬浮的细胞是活细胞在换液和传代时需要离心回收，这些悬浮细胞团可以通过使用移液器（5mL或者更小）来吹散，重新打入到贴壁细胞培养瓶中。丢弃这些悬浮细胞会使细胞密度变低，细胞生长缓慢。

3.使用BC-CE-005胰酶-EDTA消化液（0.25%胰酶，含酚红）消化细胞。

4.细胞消化较快，室温消化即可；消化时不要通过敲击或摇晃培养瓶来搅动细胞，以免形成细胞团。

应用^[4-5]

MCF-7B人乳腺癌细胞系可以用于miR let-7b抑制乳腺癌MCF-7细胞迁移及其机制的研究

探讨miR let-7b是否抑制乳腺癌细胞迁移及其可能与IL-6相关的作用机制，在评估乳腺癌患者的转移及临床早期预防和治疗方面乳腺癌细胞的转移提供理论依据。

方法：1.体外培养人乳腺癌MCF-7细胞，将实验组分为四组：空白对照组、miR let-7b转染组、miR-control转染组、anti-miR let-7b转染组并分别转染对应的人工合成miRNA，应用划痕实验方法，在显微镜下观察转染后24h不同实验组划痕距离的改变而判断细胞迁移能力的变化。

2. miR let-7b转染组、miR-control转染组、anti-miR let-7b转染组分别转染对应的人工合成miRNA培养48h后，粉碎细胞、提取RNA并反转录cDNA及提取蛋白，运用PCR和蛋白质印迹法(Western blot)检测细胞内IL-6的表达水平。

3. 通过capitalbio数据库和生物信息学软件TargetScan、DIANA-micoT3.0这两个软件两两比对，用载体构建、双荧光酶素报告基因方法验证miR let-7b与IL-6结合。

4. 统计学分析：所有数据资料以均数±标准差(x±S)表示。采用SPSS17.0统计软件统计处理，用方差分析方法进行各实验组结果数据对比，采用LSD-t检验方法进行两两比较，认为当P<0.05时数据差异有统计学意义。

结果：1.划痕实验：将转染miR-control、miR let-7b、anti-miR let-7b以及未转染的MCF-7细胞分别接种于6孔板中，分为空白对照组、miR-control转染组、miR let-7b转染组、anti-miR let-7b转染组，待细胞贴壁长满进行划痕实验，在细胞生长0h、24h后分别进行拍照，结果显示转染miR let-7b的细胞的划痕距离与空白对照组细胞的划痕距离相比明显增大，而转染anti-miR let-7b的细胞其划痕距离远小于空白对照组划痕距离。miR let-7b组与anti-miR let-7b组划痕距离差距更为明显，本实验方法表明miR let-7b能够明显抑制乳腺癌MCF-7细胞的迁移能力，而anti-miR let-7b能够明显促进乳腺癌MCF-7细胞的迁移。

2. PCR实验：将转染miR-control、miR let-7b、anti-miR let-7b的乳腺癌MCF-7细胞培养48h后粉碎并提取总RNA、反转cDNA，以其为模板进行PCR，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测并照相，并分析灰度值。miR-control、miR let-7b组和anti-miR let-7b组的PCR灰度值（IL-6/GADPH）为0.89±0.24，0.23±0.18，1.03±0.21，经比对各组PCR条带灰度值总体比较时差异有统计学意义（F=5.77，P<0.01）。经miR let-7b转染后的人乳腺癌MCF-7细胞，IL-6的表达强度与其余对照组相比明显降低（t=5.32），而经anti-miR let-7b转染的细胞株内IL-6表达水平显著增高（t=4.00），其差别均有统计学意义(P<0.05)。miR let-7b组与anti-miRlet-7b组灰度值差异更为显著。实验结果说明miR let-7b明显抑制IL-6的表达水平，而anti-miR let-7b能够提高IL-6的表达水平。

3.蛋白质印迹法(Western blot)：将转染miR let-7b、miR-control、anti-miR let-7b的乳腺癌MCF-7细胞培养48h后粉碎并提取总蛋白，实验后行灰度值分析，蛋白质条带印迹灰度值（IL-6/β-肌动蛋白）分别为miR-control组0.76±0.28，miR let-7b组0.59±0.16，anti-miR let-7b组为1.22±0.23，各实验组对比时发现各实验分组总体比较时有差异（F=6.01，P<0.01）。实验组miR let-7b与空白对照组相比，经miR let-7b转染的MCF-7细胞株中IL-6的表达水平相对降低（t=5.543，P=0.037）。而在另一实验组，anti-miR let-7b转染组内IL-6的表达水平相对增高（t=5.713，p=0.008），其差别均有统计学意义(P<0.05)。miR let-7b组与anti-miR let-7b组灰度值差异更为显著。实验结果说明miR let-7b明显抑制IL-6的表达水平，而anti-miR let-7b提高IL-6的表达水平。

参考文献

[1]Targeting miR-205 in breast cancer.Hailong Wu;;Yin-Yuan Mo.Expert Opinion on Therapeutic Targets,2009

[2]Cancer statistics by race and ethnicity.Sheryl L.Parker;Kourtney JohnstonDavis;Phyllis A.Wingo;Lynn A.G.Ries;Clark W.Heath.CA:A Cancer Journal for Clinicians,2008

[3]Expression of microRNAs and protein‐coding genes associated with perineural invasion in prostate cancer.Robyn L.Prueitt;MingYi;Robert S.Hudson;Tiffany A.Wallace;Tiffany M.Howe;Harris G.Yfantis;Dong.H.Lee;Robert M.Stephens;Chang‐GongLiu;George A.Calin;Carlo M.Croce;StefanAmbs.Prostate,2008

[4]The role of microRNAs in cancer:No small matter.Erik A.C.Wiemer.European Journal of Cancer,2007

[5]曲杰.miR let-7b抑制乳腺癌MCF-7细胞迁移及其机制的研究[D].承德医学院,2014.