人高转移肺癌细胞的应用

背景^[1-3]

人高转移肺癌细胞是分离自一位具有高度转移特性的非小细胞肺癌患者，该细胞均有广泛转移特性，在动物实验中可出现静脉转移，淋巴管转移及种植转移现象。

人高转移肺癌细胞

人高转移肺癌细胞培养步骤

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备RPMI-1640培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2）人高转移肺癌细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）人高转移肺癌细胞冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二．人高转移肺癌细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.收到细胞后首次传代推荐将细胞悬液按1：2的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中，建议客户冻存一支备用，后续传代根据实际情况按1:2到1:5的比例进行。

3）人高转移肺癌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

1，细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2，4min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x10E6/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3，将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

人高转移肺癌细胞可以用于miR-5481对人高转移95D肺癌细胞增殖、凋亡和迁移的影响

研究has-miR-5481(miR-5481)对人高转移肺癌细胞增殖、凋亡和迁移的影响。

方法：通过体外瞬时转染法将miR-5481的表达载体质粒用脂质体转染人高转移肺癌细胞,然后利用实时荧光定量PCR技术检测转染后人高转移肺癌细胞中miR-5481的表达；以人低转移95C肺癌细胞(95C组)、未转染人高转移肺癌细胞(95D组)、转染空白载体质粒的人高转移肺癌细胞(NC组)作为对照,通过MTT法测定转染后95D肺癌细胞增殖能力的变化,利用流式细胞计数分析法评估转染后人高转移肺癌细胞的凋亡情况,用Transwell小室分析转染后人高转移肺癌细胞迁移能力的变化。

结果：1.以人高转移肺癌细胞组中miR-5481相对表达量作为1,NC组和miR-5481转染组中miR-5481相对表达量分别为(3.032±0.198)(2418.539±171.096),与人高转移肺癌细胞组和NC组相比较,miR-5481相对表达量有显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。

2. MTT法检测4天内细胞增殖能力的变化发现,miR-5481转染组与NC组相比较,细胞的增殖能力无显著性差异(P>0.05),提示miR-5481对人高转移肺癌细胞的增殖无明显影响。

3. 流式细胞测细胞凋亡实验发现,95C组、人高转移肺癌细胞组、NC组和miR-5481转染组细胞凋亡百分数分别为(20.75±9.96)%、(10.33±0.25)%、(39.27±1.65)%和(53.77±1.89)%,与95C组、人高转移肺癌细胞组和NC组相比较,miR-5481转染组细胞的凋亡数明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05),提示miR-5481能够促进人高转移肺癌细胞的凋亡。

4. Transwell小室检测细胞迁移能力发现,95C组、人高转移肺癌细胞、NC组和miR-5481转染组细胞迁移个数分别为(32.50±0.71)(43.50±2.12)、(43.05±1.34)和(18.35±2.33),与95C组、95D组和NC组相比较,miR-5481转染组细胞的迁移能力明显下降,差异具有统计学意义(P<0.01),提示miR-5481能抑制人高转移肺癌细胞迁移。

结论：过表达miR-5481能够促进人高转移肺癌细胞的凋亡并能抑制人高转移肺癌细胞的迁移能力。

参考文献

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[5]陈成艳.miR-5481对人高转移95D肺癌细胞增殖、凋亡和迁移的影响[D].中南大学,2013.