漏斗状带绦虫PCR试剂盒的应用

背景^[1-3]

漏斗状带绦虫PCR试剂盒是用于检测漏斗状带绦虫的特异性的分子生物学试剂，它根据PCR（聚合酶链式反应）原理进行开发。这种试剂盒的特点是即开即用，只需要提供DNA模板，无需经过复杂的前处理步骤。

漏斗状带绦虫PCR试剂盒

漏斗状带绦虫PCR试剂盒使用方法

一、稀释标准曲线样品（以10E2-10E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。

1.标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。

2.用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR模板稀释液，*用带芯枪头，下同）。

3.在7号管中加入5μL阳性对照（浓度为1×10E8拷贝/μL，试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E7拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4.换枪头，在6号管中加入5μL 1×10E7拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5.换枪头，在5号管中加入5μL 1×10E6拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6.重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

7.用自选方法纯化样品的DNA，本产品跟市场上绝大多数核酸纯化产品兼容。

8.如果有N个样品，则需要进行N+2个样品提取，多出的一个用作样品制备阳性对照管、另一个用作样品制备阴性对照管。

三、设置qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）

9.如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照。

应用^[4-5]

漏斗状带绦虫PCR试剂盒可以用于云南亚洲带绦虫MPCR鉴定及遗传多态性比较性分析研究

1. 运用漏斗状带绦虫PCR试剂盒多重聚合酶链式反应（MPCR）技术对云南保山、怒江、大理、迪庆四地区亚洲带绦虫标本单链结合蛋白（HDP2）基因进行鉴定，排除未用统一方法鉴定的亚洲带绦虫标本的假阳性。

2. 对云南四地区带绦虫不同的基因片段聚合酶链式反应（PCR）测序方法进行比较性分析，探索带绦虫遗传多态性研究中快速可靠的基因序列。

3. 为亚洲带绦虫的分类定位提供依据，明确亚洲带绦虫在云南的分布区域与流行现状。

方法：1.采用漏斗状带绦虫PCR试剂盒MPCR技术统一对亚洲带绦虫HDP2基因序列进行鉴定研究，结合云南大理、怒江、普洱三种标准株电泳图，MPCR扩增带绦虫HDP2部分基因序列，绘制电泳图。

2. 收集整理本课题组对各地带绦虫基因序列线粒体DNA（mtDNA）中的12S rRNA、ND1、COX1、Cytb和核糖体DNA（rDNA）中的（ITS1、ITS2）的研究结果；比较分析碱基序列中的碱基变异率、A+T含量，PCR扩增时间，SPSS13.0软件分析，绘制图谱，进一步分析六组基因片段变异率是否相同。

结果：1.云南保山、怒江、大理、迪庆地区14株带绦虫HDP2基因鉴定结果显示：1—14号标本与YZ的电泳图在同一条带处出现。

3. mtDNA-12S rRNA、mtDNA-ND1、mtDNA-COX1、mt-DNA Cytb、rDNA-ITS1、rDNA-ITS2基因序列在带绦虫遗传多态性研究中的比较分析显示：mtDNA-ND1基因的碱基变异率高于mtDNA-12S rRNA基因的碱基变异率；mtDNA-ND1基因的A+T平均含量高于mtDNA-12S rRNA基因的A+T平均含量；mtDNA-ND1基因之间的同源性差异高于mtDNA-12S rRNA基因之间的同源性差异。rDNA-ITS1基因的碱基变异率高于rDNA-ITS2基因的碱基变异率；rDNA-ITS1基因的A+T平均含量高于rDNA-ITS2基因的A+T平均含量；rDNA-ITS1基因之间的同源性差异高于rDNA-ITS2基因之间的同源性差异。

4. 楚雄、普洱、西双版纳存在牛带绦虫；保山存在亚洲带绦虫与牛带绦虫；大理存在猪带绦虫、牛带绦虫和亚洲带绦虫。

结论：1.云南保山、怒江、大理、迪庆地区存在亚洲带绦虫；普洱、西双版纳、楚雄存在牛带绦虫；保山存在亚洲带绦虫与牛带绦虫；大理存在猪带绦虫、牛带绦虫和亚洲带绦虫。

2. MPCR技术在带绦虫分类学研究中可作为一种可靠、有效、方便快捷的方法加以应用。

3.mtDNA-ND1基因序列和rDNA-ITS1基因序列在带绦虫遗传多态性研究中显出优越性。

参考文献

[1]Characterization of the Taenia spp HDP2 sequence and development of a novel PCR-based assay for discrimination of Taenia saginata from Taenia asiatica.González Luis;;Bailo Bego?a;;Ferrer Elizabeth;;García Maria;;Harrison Leslie;;Parkhouse Michael;;McManus Donald;;Gárate Teresa.Parasites&Vectors,2010

[2]Loop-mediated isothermal amplification method for differentiation and rapid detection of Taenia species..Nkouawa Agathe;;Sako Yasuhito;;Nakao Minoru;;Nakaya Kazuhiro;;Ito Akira.Journal of clinical microbiology,2009

[3]Neurocysticercosis:detection of Taenia solium DNA in human cerebrospinal fluid using a semi-nested PCR based on HDP2.Hernández M.;Gonzalez L.M.;Fleury A.;Saenz B.;Parkhouse R.M.E.;Harrison L.J.S.;Garate T.;Sciutto E..Annals of Tropical Medicine&Parasitology,2008

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[5]李彦.云南亚洲带绦虫MPCR鉴定及遗传多态性比较性分析研究[D].大理学院,2012.