小鼠逆转录病毒包装株的应用

背景^[1-3]

小鼠逆转录病毒包装株是源于TK-NIH/3T3的逆转录病毒包装细胞。PT67 is a retrovirus packaging cell line derived from TK-NIH/3T3 cells.细胞产生可结合长臂猿白血病病毒受体Glvr-1或双嗜性逆转录病毒受体Ram-1的复制缺陷逆转录病毒载体颗粒。

小鼠逆转录病毒包装株

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备DMEM（推荐iCell-0001）培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2）小鼠逆转录病毒包装株培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）小鼠逆转录病毒包装株冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二．小鼠逆转录病毒包装株细胞处理：

1）冻存细胞的复苏：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2）小鼠逆转录病毒包装株细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。

3.轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3）小鼠逆转录病毒包装株细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

1.细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×10^6~1×107个活细胞/ml.

2.1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞，按每1ml冻存液含1×10^6~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

3.将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。

应用^[4-5]

小鼠逆转录病毒包装株可以用于逆转录病毒介导GW112基因在胃癌SGC-7901细胞中的表达研究

利用荧光定量PCR技术,分析GW112基因在胃癌组织、癌旁组织以及正常胃粘膜组织中的表达差异。其次,利用逆转录病毒载体pLEGFP-N1系统,构建人GW112基因增强型表达载体pLEGFP-N1-GW112,并将其包转出逆转录病毒,构建GW112基因在胃癌细胞稳定过表达的细胞模型,为深入了解GW112在胃癌中的作用及抗凋亡机制,奠定基础。

本课题实验内容与结果包括以下几个方面:

1、分析比较GW112基因在胃癌组织、癌旁组织以及正常胃粘膜组织中的表达差异。收集23例胃癌组织、癌旁组织以及正常胃粘膜组织,抽提总RNA,设计合成GW112与β-actin的特异引物,利用实时定量PCR分析三者间GW112基因的表达差异。结果显示:与癌旁组织以及正常胃粘膜组织相比,GW112基因在胃癌组织明显上调(3-6倍);而癌旁组织以及正常胃粘膜组织相比无较大差异(1.3倍);研究显示GW112基因在胃癌组织属过表达,与国外研究基本一致。

2、建立GW112稳定过表达的SGC-7901细胞模型。构建pLEGFP-N1-GW112重组逆转录病毒载体,转染小鼠逆转录病毒包装株PT67包装细胞进行病毒包装。经G418筛选,建立稳定的产毒的小鼠逆转录病毒包装株PT67-GFP与小鼠逆转录病毒包装株PT67-GW112细胞。

收集病毒经纯化感染SGC-7901细胞,再次经过G418筛选稳定筛选,建立起SGC-7901-GFP对照细胞以及GW112稳定过表达的SGC-7901-GW112细胞株。实时定量PCR用于分析GW112基因的表达。

1) 、PCR扩增携带信号肽序列的GW112基因,扩增产物经限制酶消化克隆入逆转录病毒载体pLEGFP-N1的SalI与BamHI位点间,构建pLEGFP-N1-GW112重组逆转录病毒载体。酶切与测序结果分析显示重组质粒构建正确,且GW112基因与基因库中NM.006418序列一致。

2) 、pLEGFP-N1-GW112与pLEGFP-N1对照经脂质体Lipofectamine 2000.转染如PT67包装细胞,经G418筛选,获得稳定产毒株PT67-GFP及PT67-GW112。

3) 、裂解后产生的病毒感染SGC-7901细胞,再次经G418筛选,获得了SGC-7901-GFP与SGC-7901-GW112的稳定克隆。实时定量PCR检测稳定克隆间GW112基因表达水平。结果显示:逆转录病毒介导的GW112基因能稳定而持久的增强GW112基因在胃癌SGC-7901细胞中的表达。

研究GW112基因在胃癌细胞中功能的前期工作。通过构建稳定高表达GW112的人胃癌细胞SGC7901细胞株,对进一步研究GW112基因表达对胃癌细胞的生物学行为及表型的影响,探索其分子机制,为侵袭性胃癌的早期诊断及治疗奠定良好的基础。

参考文献

[1]The glycoprotein hGC-1 binds to cadherin and lectins.Wenli Liu;;Ling Chen;;Jianchong Zhu;;Griffin P.Rodgers.Experimental Cell Research,2006

[2]Molecular-pathological prognostic factors of gastric cancer:a review.Wataru Yasui;;Naohide Oue;;Phyu Phyu Aung;;Shunji Matsumura;;Mariko Shutoh;;Hirofumi Nakayama.Gastric Cancer,2005

[3]Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference.Thijn R Brummelkamp;;RenéBernards;;Reuven Agami.Cancer Cell,2002

[4]Identification and characterization of a novel member of olfactomedin-related protein family,hGC-1,expressed during myeloid lineage development.Jiachang Zhang;;Wen-Li Liu;;Delia C Tang;;Ling Chen;;Min Wang;;Svetlana D Pack;;Zhengping Zhuang;;Griffin P Rodgers.Gene,2002

[5]杨梅华.逆转录病毒介导GW112基因在胃癌SGC-7901细胞中的表达研究[D].第三军医大学,2012.