尿促性素的纯化

背景及概述^[1][2]

尿促性素是由人脑下垂体前叶部分分泌的一种糖蛋白促性腺激素，一般是从绝经期或绝经期后妇女的尿液中经提取纯化而制得。妇女在行经期间尿促性素的含量有所波动，但较低，只有妇女进入绝经期或之后的十几年中，其尿中尿促性素的含量方达到高峰(60-100iu／L尿)，并能维持在一个稳定的水平上，尿促性素含有卵泡刺激素(FSH)和黄体生成素(LH)，其所含比例近似1：1。临床主要用于治疗妇女因功能性不排卵所致的不育症；男性因激素水平低下所引起的精子过少或活力不足。另外，还用于治疗诸如妇女闭经、月经不调、男女性机能失调等症。

1928年Ascbheim首先报道了从更年期妇女尿液中发现了活性物质，之后报道虽不少，但真正对尿促性素的了解和制备，是从20世纪60年代的Donimi开始，并逐渐形成比较规范化的工艺来制备的。我国从20世纪70年代开始研究，80年代正式进入临床试验阶段，90年代开始大量生产。

高纯度的尿促性素（HP-尿促性素）是从天然提取的促性腺激素制剂，纯度达到了重组单组分制剂的水平。HP-尿促性素相比于普通纯度的尿促性素，应当具备纯度高、杂质少的优点，基于这些优点，HP-尿促性素不会造成人体的过敏反应，且可以使用皮下注射，提高患者的顺应性。

专利US7022822B1中公布了一种高纯度尿促性素的制备方法，工艺为尿促性素粗品先用阳离子交换层析纯化，再经阴离子交换层析，最后使用疏水层析技术。由于FSH与LH在疏水性质上差异较大，要同时纯化两者需要使用较强的洗脱条件，比如添加乙醇，才能将两者同时洗脱，此洗脱条件会将疏水性介于FSH与LH中间的杂质蛋白洗脱，因此最终产品比活性只有4000IU/mg蛋白质左右。要制备更高纯度的尿促性素，需要开发使用更有效的分离技术，将FSH与LH同时纯化，使其达到最终的1:1比例，同时，尽量去除杂质蛋白。

尿促性素

提纯方法^[3]

将尿促性素粗制品作为起始原料，其FSH生物效 价为10IU/mg，LH生物效价为9IU/mg，FSH比活性为16IU/mg蛋白质。

1. Capto DEAE 阴离子交换层析

用1000ml水溶解60g 尿促性素粗制品，调节溶液的pH值至5.0，将此溶液上样至柱体积为 1250ml的Capto DEAE层析柱（购自GE公司），层析柱预先用平衡液（0.02M PB，pH5.0）平衡 好；FSH和LH不能吸附，直接流穿，收集上样流穿液，上样结束后用平衡液洗涤未吸附的蛋 白，与上样流穿液合并收集。并检测洗涤液在280nm处的吸光值，直至吸光值不再下降；此收 集液即为中间体I。

2. CM-Sepharose 阳离子交换层析

中间体I用6KD的超滤膜浓缩至约100ml，调整pH及电导率与CM-Sepharose 阳离子交换 层析平衡液一致，上样至柱体积为120ml的 CM-Sepharose 层析柱（购自GE公司），层析柱预 先用平衡液平衡好；上样结束后用平衡液洗涤未吸附的蛋白，并检测洗涤液在280nm处的吸 光值，直至吸光值不再下降；再用洗脱液（0.1M HAc-NaAc+0.2M NaCl，pH5.5）洗脱FSH，并检 测洗脱液在280nm处的吸光值，直至吸光值不再下降，共收集洗脱流出液460ml，即为中间体 II。

3. Capto Blue (high sub)染料亲和层析

将中间体II 460ml调节pH及电导率与平衡液（0.1M NaAc，pH7.0）一致，上样至已平衡 好的柱体积为35ml的Capto Blue (high sub) 层析柱（购自GE公司）；上样结束后用平衡液 洗涤未吸附的蛋白，并检测洗涤液在280nm处的吸光值，直至吸光值不再下降；再用洗脱液 （0.02M PB+1.5M KCl，pH 9.0）洗脱FSH，并检测洗脱液在280nm处的吸光值，直至吸光值不 再下降，共收集洗脱流出液70ml，即为高纯度尿促性素。

将高纯度尿促性素溶液用截留分子量为6KD的超滤膜超滤浓缩后，用0.01M PB缓 冲溶液(pH 6.0)换盐3次，按照3%（w/v）的比例添加乳糖配制成冻干原液，冷冻干燥后得到 0.84g高纯度尿促性素成品。

主要参考资料

[1] 张建伟, & 连方. (2006). 补肾中药联合尿促性素诱导排卵的临床研究. 江苏中医药, 27(1), 30-32.

[2] 张建伟, & 连方. (2006). 补肾中药联合尿促性素诱导排卵的临床研究. 江苏中医药, 27(1), 30-32.

[3] 郑彤彤, 陈丽君, & 冯云. (2006). 尿促性素治疗耐克罗米芬多囊卵巢综合征不孕症患者的临床观察. 中国现代应用药学, 23(3), 246-248.