小鼠胰岛细胞的应用

背景^[1-3]

小鼠胰岛细胞分离自胰岛组织；小鼠胰岛细胞是分布于胰外分泌部腺泡间的内分泌细胞团，遍布于胰的各部，分布不均，以胰尾最多。胰岛大小不等，小的只有几个细胞，大的有数百个细胞。此外也有零散的内分泌细胞位于腺泡和导管附近。胰岛由薄层网状纤维组成的被膜包被，但被膜并不完全。胰岛的细胞配布成索，细胞索间毛细血管丰富。细胞比腺泡细胞小，呈多边形和圆形，大小不等，胞质染色浅。核圆，位于细胞中央，染色质颗粒较密，小鼠胰岛细胞研究在糖尿病研究中具有重要价值。

小鼠胰岛细胞

小鼠胰岛细胞分离和体外培养的方法：

1. 将小鼠仰卧位放置在解剖镜下，酒精消毒皮肤，从腹部耻骨到前腿做V形切口。将皮肤折叠到胸部，暴露腹腔。

2. 将鼠的头部朝向操作者，定位胆总管的十二指肠入口，用止血钳夹住十二指肠开口。阻止灌入的酶液流入至肠道。

3. 掀起肝脏暴露胆总管，使用27 G针头的注射器自胆总管灌流酶液，注意针头掰弯成70度角，缓缓灌入酶液。当2毫升的酶液充满胰腺时，十二指肠附近的区域开始首先扩张，接着是胃顶部的区域，最后是脾尾。最终使整个胰腺的均匀扩张。

4. 一旦胰腺被灌注完成，就可以将胰腺从肠，胃和脾脏周围慢慢拉出腹腔。放入50毫升锥形管中，放在冰上。不建议将灌注的胰腺放在冰上超过1小时。

5. 将再悬浮的组织通过直径0.419毫米钢丝网过滤倒入新鲜10%FBS培养基的50ml离心管中。4℃离心管800rpm离心2分钟。

小鼠胰岛细胞培养方法

小鼠胰岛细胞是一种贴壁细胞，细胞形态呈梭形、多角形样，不建议传代；建议您收到细胞后尽快进行相关实验。

收到细胞后，请按照以下方法进行操作。

1.取出T25细胞培养瓶，用75%酒精消毒瓶身，拆下封口膜，放入37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中静置3-4h，以稳定细胞状态。

2.贴壁细胞消化

1)吸出T25细胞培养瓶中的培养基，用PBS清洗细胞一次；

2)添加0.25%胰蛋白酶消化液1mL至T25培养瓶中，轻微转动培养瓶至消化液覆盖整个培养瓶底后，吸出多余胰蛋白酶消化液，37℃温浴1-3min；倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后，再加入5ml完全培养基终止消化；

3)用吸管轻轻吹打混匀，按传代比例接种T25培养瓶传代，然后补充新鲜的完全培养基至5mL，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中静置培养；

4)待小鼠胰岛细胞完全贴壁后，培养观察；之后按照换液频率更换新鲜的完全培养基。

应用^[4-5]

小鼠胰岛细胞可以用于基于小鼠胰岛β细胞系MIN6构建两种常用胰岛体外模型的比较研究

基于小鼠胰岛β细胞系Min6细胞构建无支架的细胞球和封装于海藻酸凝胶中的分散细胞二种不同的三维(three-dimensional,3D)细胞培养体系。与传统的二维(two-dimensional,2D)贴壁细胞相比,比较这三种培养方式下胰岛素分泌功能的差异并对其存在的机制进行初步的研究。

方法:(1)采用Solid-works设计出深度、直径可调的模具,利用3D打印技术制备出模具,并构建琼脂糖微孔矩阵培养3D Min6细胞球;

(2) 采用海藻酸钠封装MIN6细胞构建3D细胞微囊,采用Calcein AM/PI死活染色检测不同浓度的海藻酸钠水凝胶以及解交联剂对MIN6细胞微囊存活的影响;

(3) 采用Cell Titer-Glo(?)3D化学发光法评估MIN6细胞在不同浓度的海藻酸钠水凝胶以及2D,3D培养下的增殖差异;

(4) 扫描电子显微镜观察细胞球和海藻酸钠微囊的表面特征。

(5) 实验分组:2D组、细胞球组、细胞微囊组;

(6) Western blot、IF、RT-q PCR分别检测Min6细胞胰岛功能相关蛋白GLUT2、PDX1、Insulin(INS)和基因GLUT2、PDX1、INS2、NKX2.2的表达差异;

(7) 酶联免疫吸附实验ELISA检测葡萄糖刺激Min6细胞下的胰岛素分泌差异;(8)Western Blot检测三种培养方式下胰岛素分泌相关信号通路PI3K/AKT/FoxO1的表达变化;(9)Western Blot检测不同浓度的海藻酸钠封装的细胞胰岛素分泌相关信号通路PI3K/AKT/FoxO1的表达变化。

结果:(1)琼脂糖表面可形成整齐排列的微孔矩阵,MIN6细胞在微孔内可聚集形成大小均一,紧密的细胞球。

(2) 死活染色与增殖结果显示,1%(w/v)海藻酸钠水凝胶装封适合MIN6细胞生长。

(3) 增殖检测结果显示,二种3D培养均能有效促进MIN6细胞的增殖。

(4) 扫描电镜结果显示,细胞球之间细胞互相融合、紧密聚集成微组织,细胞在水凝胶基质上形成单层簇状或多细胞簇状在局部生长。

(5) 免疫荧光结果显示,GLUT2,PDX1,INS的信号强度,细胞球组最明显,水凝胶组和2D组差异不明显。

(6) ELISA结果显示高糖或低糖刺激下,与2D相比,3D培养促进胰岛素分泌量更高(P<0.05),其中水凝胶组胰岛素分泌高于细胞球组(P<0.05)。

(7) RT-q PCR结果显示,3D培养有利于促进GLUT2、PDX1、INS2和NKX2.2基因的表达,其中水凝胶组对基因表达的上调作用(P<0.001)。

(8) Western blot结果显示,MIN6细胞在不同培养条件下,GLUT2的表达无显著性差异,PDX1,INS表达趋势和RT-q PCR一致。

(9) Western blot结果显示,PI3K,p-AKT/AKT,p-FoxO1/FoxO1和PDX1蛋白的表达水平,水凝胶组明显高于其他两组(P<0.05)。其中,细胞球组的表达水平也比2D组高,统计没有显著差异。

(10)不同浓度水凝胶封装MIN6细胞,Western blot结果显示,PI3K的表达,0.5%和1%(w/v)差异不明显,2%(w/v)的显著降低(P<0.05);p-AKT/AKT,p-FoxO1/FoxO1,PDX1的表达1%表达最高(P<0.05),0.5%和2%(w/v)之间无显著性差异。

参考文献

[1]Advanced Strategies for 3D Bioprinting of Tissue and Organ Analogs Using Alginate Hydrogel Bioinks.Gao Qiqi;Kim ByoungSoo;Gao Ge.Marine Drugs,2021

[2]The PI3K/Akt signaling axis in Alzheimer’s disease:a valuable target to stimulate or suppress?.Razani,Elham;Pourbagheri Sigaroodi,Atieh;Safaroghli Azar,Ava;Zoghi,Anahita;Shanaki Bavarsad,Mahsa;Bashash,Davood.Cell Stress and Chaperones,2021

[3]Mutant Huntingtin Impairs Pancreaticβ-cells by Recruiting IRS-2 and Disturbing the PI3K/AKT/FoxO1 Signaling Pathway in Huntington's Disease..Li Li;Sun Yun;Zhang Yinong;Wang Weixi;Ye Cuifang.Journal of molecular neuroscience:MN,2021

[4]Pancreas transplant versus islet transplant versus insulin pump therapy:in which patients and when?.Tamburrini Riccardo;Odorico Jon S..Current Opinion in Organ Transplantation,2021

[5]晁新新.基于小鼠胰岛β细胞系MIN6构建两种常用胰岛体外模型的比较研究[D].南昌大学,2023.