卵泡刺激素的作用

背景及概述^[1][2]

卵泡刺激素是一种促性腺激素类可注射蛋白质药物，主要用于女性和男性病人不孕和生殖紊乱的治疗。卵泡刺激素还可用于女性病人辅助生殖技术(ART)中的诱导排卵(OI)和控制性超排卵(COH)。卵泡刺激素还被用于诱导精子减少的男性病人的精子产生。由于卵泡刺激素在治疗生殖紊乱中的重要性，所以提供高纯度和高比活性的卵泡刺激素。

尿卵泡刺激素(u‑卵泡刺激素)是以人绝经期促性腺激素(HMG)为原料，采用现代化生物技术纯化而得的。根据尿卵泡刺激素国家标准的记载：“本品为绝经妇女尿中提取的促性腺激素，主要包含卵泡刺激素(Follicle‑stimulating Hormone，简称卵泡刺激素)，几乎不含黄体生成素(Luteinising Hormone，简称LH)”，表明该产品的主要成分为单组分高纯度的卵泡刺激素，不似其它多组分生化药物的组成复杂，组成成分不完全明确且含有杂蛋白。

目前，国外高纯度的卵泡刺激素主要由Serono公司生产，Serono公司的生产方法包括将HMG粗品经乙醇抽提后，再经硅酸铝吸附，然后采用DEAE柱层析纯化，再经抗卵泡刺激素单克隆抗体层析柱选择性吸附，最后通过反相层析获得高纯度u‑卵泡刺激素。但是，Serono公司的生产方法存在一个很大的缺陷，即抗卵泡刺激素单克隆抗体层析需采用氨水进行洗脱，条件剧烈，容易破坏卵泡刺激素的结构，影响成品的质量和提取效率。

作用

卵泡刺激素(Follicle-stimulatinghormone,卵泡刺激素)是一种由动物脑垂体前叶分泌的糖蛋白类促性腺激素。具有调节机体的生长、性成熟和繁殖等作用。

卵泡刺激素在雌性动物可促进子宫内膜生长、排卵、刺激多卵泡发育等。靶细胞上存在着卵泡刺激素的特异性受体,卵泡刺激素与细胞膜上的卵泡刺激素受体结合后,通过G蛋白偶联机制激活腺苷酸环化酶,使细胞内cAMP增加或引起钙离子内流,从而对细胞的代谢或功能活动产生影响。卵泡刺激素与受体结合后产生两种作用。一方面活化芳香化酶,另一方面诱导LH受体形成。

内膜细胞在LH的作用下提供19碳底物-雄烯二酮或睾酮这些底物通过基底膜进入颗粒细胞,活化的芳香化酶把它们转变为17-β雌二醇(E2),而卵泡内膜本身只能产生很少量的雌激素。雌激素协同卵泡刺激素使颗粒细胞增生,内膜细胞分化,卵泡液形成卵泡腔扩大,从而使卵泡生长和发育。

用于生产尿卵泡刺激素的原料HMG主要包含卵泡刺激素与黄体生成素。黄体生成素的效价与卵泡刺激素效价的比值约为1(中国药典2010年版二部尿促性腺激素，第378页)。从HMG的电泳分析结果还可以看出，其中还含有大量的杂蛋白。制备高纯度尿卵泡刺激素需要除去HMG中的LH和其他尿蛋白质，保留高纯度单一活性组分的卵泡刺激素，获得成分单一、明确的生化药品。

卵泡刺激素是垂体前叶细胞分泌的一种蛋白质激素。在男性，作用于睾丸曲细精管，可促进精子形成；作用于支持（Sertoli）细胞分泌雌二醇。在女性，促进卵泡颗粒层细胞增生分化，促进卵巢长大。目前卵泡刺激素的检测主要是通过酶联免疫法和化学发光法。这些方法都是直接或间接的检测卵泡刺激素本身，没有检测其生物活性。而唯有生物活性与临床症状体征相关。同时，由于酶联免疫法和化学发光法都是通过免疫反应原理进行检测，其检测的敏感性受到极大限制。

卵泡刺激素

检测^[3]

制备检测卵泡刺激素的均相免疫检测试剂套装：

(1)与抗体结合的受体的制备：

用作本实施例的受体是含有醛基(-CHO)包被在乳胶颗粒上形成填充有二甲基噻吩的衍生物和镧系元素Eu的螯合物的微粒(发光微球)。受体通过醛基与抗体分子连接。

生物原料：卵泡刺激素单克隆抗体

制备过程：取2mg发光微球溶液，并用0.05MpH9.6的碳酸盐缓冲液(CB)将其稀释成5mg/ml；取卵泡刺激素单克隆抗体0.02mg转移至稀释后的发光微球溶液中，充分混匀、4℃过夜；再加入用0.05MpH9.6的CB缓冲液稀释成10mg/ml的BSA溶液20uL，室温旋转2h；充分洗涤微球，最后用pH8.00.1M的Tris-HCl溶液将微球稀释至0.5mg/ml，获得试剂R1。

(2)与生物素标记结合的抗体的制备过程

生物原料：活化生物素以及卵泡刺激素单克隆抗体

制备过程：取卵泡刺激素单克隆抗体0.5mg转移至14KD透析袋内，用标记缓冲液(0.1MNaHCO3)透析，2h/次，换液1次；加入5mg/ml的生物素溶液10ul，迅速混匀，补充标记缓冲液至500μl，2-8℃混匀过夜，标记比例为1:30(抗体:生物素-摩尔比)；将标记完成的Bio-Ab转移至14KD透析袋，用透析缓冲液(0.1MTris-HCl)透析，2h/次，换液1次；用pH8.00.1MTris-HCl溶液稀释至5μg/ml，获得试剂R2。

(3)与链霉亲和素结合的供体的制备

a、感光微球(供体)混悬液处理：吸取一定量的感光微球于高速冷冻离心机中离心，弃去上清，加入一定量MES缓冲液，超声细胞破碎仪上超声至微粒重新悬浮，加入MES缓冲液调节感光微球浓度至100mg/ml。

b、链霉亲和素溶液配制：称量一定量链霉亲和素，加MES缓冲液溶解至8mg/ml。

c、混合：将处理好的感光微球(供体)混悬液、8mg/ml的链霉亲和素溶液以及MES缓冲液，以2:5:1的体积比进行混合，迅速混匀，得到反应液。

d、反应：MES缓冲液配制25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照与反应液1:25的体积比加入，迅速混匀，37℃旋转反应48小时。

e、封闭：MES缓冲液配制75mg/ml的Gly溶液以及25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照与反应液2:1:10的体积比加入上述溶液中，混匀，37℃旋转反应2小时。再加入200mg/ml的BSA溶液(MES缓冲液)，其与反应液体积比为5:8，迅速混匀，37℃旋转反应16小时。

f、清洗：向反应好的溶液中加入MES缓冲液，高速冷冻离心机离心，弃上清，加入新鲜MES缓冲液超声法重新悬浮，再次离心，如此清洗3次，最后用感光试剂缓冲液进行悬浮，获得第三组合物。其中，第三组合物中组分c的浓度为100μg/mL，作为通用液使用，获得试剂R3。

(4)卵泡刺激素校准品系列稀释液的制备过程

取卵泡刺激素纯品，用含20％灭活小牛血清的0.1MpH7.4磷酸盐缓冲盐水溶液配制成各0.5ml的0、1、10、50、100、200mIU/mL校准品系列稀释液。

实施例2：采用本发明所述方法制备的试剂套装检测样本中的卵泡刺激素。

所采用的试剂套装为实施例1制备得到的卵泡刺激素的均相免疫检测试剂套。检测过程由自动光激化学发光分析系统全自动完成并输出检测结果，具体步骤：

1)在反应孔中分别加入25μl待测样本或校准品、质控品；

2)在反应孔中依次加入25μLR1和25μlR1；

3)37℃温育15分钟；

4)加入175μlR3；

5)37℃温育15分钟；

6)激光照射微孔并计算每孔的信号值；根据校准品的信号值绘制标准曲线，并通过标准曲线，计算出待测样本中卵泡刺激素的浓度。

制备^[2]

1.二乙基氨基乙基(DEAE)阴离子交换层析

1.1材料

HMG：第060602‑R2批，国药标准字H20023376，并经乙肝、丙肝和HIV病毒检验和残留溶剂检验合格。

凝胶：DEAE‑Sepharose FF(GE Healthcare)。

平衡液：0.03mol/L Tris‑HCl，pH 7.0～7.5。

洗脱液：0.15mol/L Tris‑HCl，pH 7.0～7.5。

1.2平衡液、洗脱液的pH选择

DEAE阴离子交换层析的原理是利用卵泡刺激素所带的负电荷与其他杂质所带电荷的差异进行初步分离，以去除大部分的尿蛋白杂质。当平衡液、洗脱液的pH＜7时，上样时流出液的产品损失较大；当平衡液、洗脱液的pH＞7时，即可以使卵泡刺激素带负电荷。但如果超过7.5时，产品的洗脱也大大加大，收率也明显降低，所以综合考虑选择平衡液与洗脱液的pH为7.0～7.5。

1.3操作

1.3.1柱平衡：将1.5升DEAE‑Sepharose FF装入层析柱(10×25cm)中，用平衡液15L平衡，流速为15～25ml/min。

1.3.2上样：称取HMG原料20克(1.66MIU)，加入平衡液1.5L溶解后，上柱，流速为10～15ml/min。

1.3.3洗涤：用平衡液10L洗涤，控制洗涤速度为15～25ml/min。

1.3.4洗脱：用洗脱液洗脱，控制洗脱速度为10～15ml/min。此时可以看到一条洗脱带慢慢向下移动，当洗脱带移动到柱底部时开始收集，收集体积约1.5L。

1.3.5乙醇沉淀：边搅拌边向收集的洗脱液中缓慢加入无水乙醇7.5L，搅拌至有沉淀析出，静置过夜。

1.3.6干燥：虹吸弃去上清液，然后在4000rpm下离心10min收集沉淀。沉淀用适量无水乙醇洗涤脱水，再在4000rpm下离心10min收集沉淀；沉淀置于真空干燥箱干燥，得到6.12g 卵泡刺激素。

主要参考资料

[1] 关洪斌, & 李庆章. (2002). 卵泡刺激素研究进展. 东北农业大学学报, 33(3), 306-311.

[2] 范俊, & 邓晓惠. (1998). 卵泡刺激素研究进展. 生殖与避孕(2), 122-125.

[3] 李凤娥, & 熊远著. (2001). 卵泡刺激素基因研究概况. 国外畜牧学(猪与禽)(1), 35-37.