小鼠睾丸细胞的应用

背景^[1-3]

小鼠睾丸细胞是指从小鼠睾丸中提取的特定细胞类型，具有一些独特的生物学特性。

在LH的作用下，TM3细胞可以代谢胆固醇，但对促卵泡激素没有响应。与此不同，在FSH的作用下，TM4细胞可以增加cAMP产量，但对LH无反应。这种差异化的响应性表明，TM3和TM4细胞在激素调节的特定生物学过程中具有不同的功能。

小鼠睾丸细胞

一．小鼠睾丸细胞培养基及培养冻存条件准备：

1）准备DMEM/F12（推荐iCell-0005）培养基；优质胎牛血清，2.5%；马血清，5%（推荐：iCell-002b）；双抗，1%。

2）小鼠睾丸细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）小鼠睾丸细胞冻存液：90%FBS，10%DMSO，现用现配。

二．小鼠睾丸细胞处理：

1）冻存细胞的复苏：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。

3.轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3）小鼠睾丸细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。下面T25瓶为例；

1.细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×106~1×107个活细胞/ml.

2.1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞，按每1ml冻存液含1×106~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

3.将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。

应用^[4-5]

小鼠睾丸细胞可以用于他克林、虾青素对LPS诱导TM4细胞和小鼠睾丸炎性损伤的保护作用

从体内、体外两个层面探索他克林、虾青素对小鼠睾丸支持细胞(Mouse testicular support cells,TM4)和小鼠睾丸的抗炎保护作用,进而助力高质量精子的产生及药物的推广应用。

具体研究内容及结果如下:试验1.小鼠TM4细胞的培养及脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导浓度探索。将小鼠TM4细胞系用含有5%马血清、2.5%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F12细胞培养基中培养,观察细胞生长周期,并采用油红O特异染色法鉴定细胞纯度,采用CCK8及ELISA法检测LPS对TM4细胞损伤的程度。

结果提示,TM4细胞培养4 h后出现贴壁;12 h后几乎全部贴壁,整体轮廓清晰并伴有触角;培养24 h之后,细胞已基本具备成熟细胞的轮廓伸出触角,呈不规则型且开始增殖;培养48 h之后,细胞之间相互连接形成网状,逐渐形成单层贴壁细胞。油红O染色细胞纯度>98%,其中LPS浓度为1μg/m L诱导处12 h更容易产生炎性损伤(P<0.05),且显著上调细胞培养上清炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β的表达(P<0.05)。

试验2.他克林、虾青素对LPS诱导损伤TM4细胞保护作用的评价。试验分为4组(空白组,LPS组,LPS+Tac组,LPS+Asx组)。取生长状态良好的对数期TM4细胞,以每孔1×104个细胞的密度接种于6 m L培养板中,空白组加DMEM/F12溶液3 m L,LPS组加含LPS(1μg/m L)的DMEM/F12溶液3 m L,LPS+Tac组细胞先诱导损伤后再加含他克林(0.01μg/m L、1μg/m L、100μg/m L、10000μg/m L)的DMEM/F12溶液3 m L,LPS+Asx组细胞先诱导损伤后再加含虾青素(1μg/m L)的DMEM/F12溶液3 m L。按试剂盒提取细胞总RNA与蛋白质进行荧光定量PCR与WB试验。结果显示,与空白组相比,LPS组显著上调IL-6、TNF-α的m RNA及NF-κB蛋白表达(P<0.05)。LPS+Tac组高、中浓度(10000、100、1μg/m L)组,上调NF-κB蛋白表达(P<0.05),低浓度组相比高、中浓度组显著降低NF-κB蛋白表达(P<0.05)。

LPS+Asx组极显著下调IL-6、TNF-α的mRNA及NF-κB蛋白表达(P<0.01)。试验3.他克林、虾青素对LPS诱导的小鼠睾丸异常损伤保护作用的分析。选取24只5周龄正常雄性小鼠,分为4组(空白组,LPS组,LPS+Tac组,LPS+Asx组),每组6只。

空白组每只注射200μL生理盐水。LPS组小鼠腹腔注射30 mg/kg LPS诱导损伤12 h;LPS+Tac组注射30 mg/kg LPS诱导损伤12 h后,再注射0.05 mg/kg他克林保护1.5 h;LPS+Asx组注射30 mg/kg LPS诱导损伤12 h后,再注射0.8 mg/kg虾青素保护6 h。解剖取出一侧睾丸制成石蜡切片,运用HE染色法观察组织病理形态,另一侧睾丸进行q RT-PCR和WB检测。鉴定结果提示,LPS诱导损伤模型成功,且0.05mg/kg他克林、0.8 mg/kg虾青素显著抑制LPS诱导的雄性小鼠睾丸异常损伤。

参考文献

[1]Nose-to-brain drug delivery:An update on clinical challenges and progress towards approval of anti-Alzheimer drugs.Mukta Agrawal;;Swarnlata Saraf;;Shailendra Saraf;;Sophia G.Antimisiaris;;Mahavir Bhupal Chougule;;Sunday A.Shoyele;;Amit Alexander.Journal of Controlled Release,2018

[2]Current and Newly Emerging Autoimmune Diseases.Laurel J.Gershwin.Veterinary Clinics of North America:Small Animal Practice,2018

[3]Characterization of myeloid cell populations in human testes collected after sex reassignment surgery.Rosalie Ponte;;Franck P.Dupuy;;Fadi Brimo;;Vikram Mehraj;;Pierre Brassard;;Maud Belanger;;Ekaterina Yurchenko;;Mohammad-Ali Jenabian;;Nicole F.Bernard;;Jean-Pierre Routy.Journal of Reproductive Immunology,2018

[4]Novel applications for serum procalcitonin testing in clinical practice.Choi;;McCarthy.Expert Review of Molecular Diagnostics,2018

[5]蔡金霞.他克林、虾青素对LPS诱导TM4细胞和小鼠睾丸炎性损伤的保护作用[D].广西大学,2021.