小鼠角膜上皮细胞的应用

背景^[1-3]

小鼠角膜上皮细胞采用酶解法制备而来，CK-18、CK-19免疫荧光鉴定呈阳性，细胞纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

小鼠角膜上皮细胞是一种常用的细胞模型，在生物学和医学研究中具有广泛的应用。这些细胞可以用于研究角膜疾病的发病机制、药物筛选和细胞替代治疗等。

在体外培养小鼠角膜上皮细胞时，需要提供适宜的培养环境，包括特定的培养基、血清、生长因子等。这些细胞通常会在传代后逐渐失去原有的细胞形态和功能，因此需要进行及时更换。

为了保证细胞的纯度和质量，需要进行细胞类型特异性标记物检测和微生物检测等质量控制措施。在实验室培养小鼠角膜上皮细胞时，也需要对细胞进行严格的操作和管理，以避免交叉感染和保证细胞的可靠性。

小鼠角膜上皮细胞

小鼠角膜上皮细胞复苏操作：

1）将培养基在37℃水浴锅预热；准备一个15mL无菌的离心管，加入8mL预热培养基。

2）将冻存小鼠角膜上皮细胞从液氮罐中取出，快速放入37℃水浴锅中复温（可准备一洁净的烧杯，装满37℃的水，细胞冻存管取出后迅速放入烧杯内，再逐步转移到水浴锅中）。轻轻晃动冻存管，使细胞能在1~2min内完全解冻，使细胞能尽快通过最易受损的温度段（-5~0℃）。注意冻存管管口不能没入水中，BIU-87(人膀胱癌细胞)避免引起污染。

3）用75%酒精擦拭冻存管后再置于超净台内，将管内细胞转移至准备好的离心管内，轻轻吹打液体，使细胞均匀分散，降低DMSO浓度，吹打时避免产生气泡。用新鲜培养基洗管壁2次，均转移至离心管内。

4）800rpm离心5min，弃上清，加入新鲜的培养基，吹打制成细胞悬液。

5）将小鼠角膜上皮细胞悬液转移至T25细胞瓶内，补加适量的培养基，轻轻晃动细胞瓶使细胞分布均匀，放入温箱内培养。

6）第二天观察细胞贴壁生长情况，换新鲜培养基以去除死细胞。继续培养，待细胞长至80~90%汇合时正常传代。一般刚复苏的细胞需经过2~3次传代，细胞活力恢复后才能进行后续的实验。

应用^[4-5]

小鼠角膜上皮细胞可以用于新型小分子复合物对小鼠角膜上皮细胞体外扩增的作用

探究六种小分子化合物(six chemicals,6C)在无血清无滋养层条件下,对原代小鼠角膜上皮细胞增殖能力和细胞分化表型的影响,并以此开发构建组织工程小鼠角膜上皮植片。

方法:原代小鼠角膜上皮细胞的培养基中添加不同的化合物组合,在经过传代/连续培养后,通过结晶紫染色、生长曲线和克隆形成效率评估原代小鼠角膜上皮细胞的增殖活性;通过免疫荧光染色和实时荧光定量PCR分析原代小鼠角膜上皮细胞和上皮-间充质细胞转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)相关基因的表达;在小鼠角膜上皮损伤愈合模型中,以6C组分溶液进行点眼处理,通过荧光素钠染色评估角膜上皮愈合速度;在空气暴露培养体系中添加不同小分子组分,通过对培养形成的角膜上皮植片进行免疫染色,评估植片中上皮细胞的生长和表型分化。

结果:在长期培养以及传代培养中,6C复合物增加了原代小鼠角膜上皮细胞的增殖活性。在体实验显示6C能够加速小鼠角膜上皮伤口的愈合。

同时,这种复合物抑制了EMT相关标记物ZEB1/2、Snail、β-catenin和α-SMA等表达水平的增加,而与此同时,维持了原代小鼠角膜上皮细胞功能相关标记物p63、K14、Pax6和K12等的表达。6C复合物的这种保护作用表明,它可以通过延长功能性干/祖细胞活性的寿命来减少其向间充质细胞的转分化。

此外,在空气暴露培养体系中添加6C复合物,可形成可用于移植手术的组织工程小鼠角膜上皮片。

结论:6C复合物既抑制了原代小鼠角膜上皮细胞增殖活性的传代依赖性下降,又抑制了EMT的增加。这些影响表明,这种新型6C复合物可能有助于改善角膜缘干细胞缺乏症的治疗。

参考文献

[1]Flow micropillar array electroporation to enhance size specific transfection to a large population of cells.Yingbo Zu;;Xuan Liu;;An-Yi Chang;;Shengnian Wang.Bioelectrochemistry,2020

[2]Highly uniform in-situ cell electrotransfection of adherent cultures using grouped interdigitated electrodes.Yicen Zhou;;Ying Lu;;Jing Cheng;;Youchun Xu.Bioelectrochemistry,2020

[3]Transcription Factor 4 Regulates the Regeneration of Corneal Endothelial Cells..Hwang Jin Sun;;Yoon Chang Ki;;Hyon Joon Young;;Chung Tae-Young;;Shin Young Joo.Investigative ophthalmology&visual science,2020

[4]HCE-T cell line lacks cornea-specific differentiation markers compared to primary limbal epithelial cells and differentiated corneal epithelium..Rubelowski Anna-Klara;;Latta Lorenz;;Katiyar Priya;;Stachon Tanja;;Käsmann-Kellner Barbara;;Seitz Berthold;;Szentmáry Nóra.Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology=Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie,2020

[5]安小娅.新型小分子复合物对小鼠角膜上皮细胞体外扩增的作用[D].厦门大学,2021.