粗球孢子菌PCR试剂盒的应用

背景^[1-3]

粗球孢子菌PCR试剂盒是即用型PCR试剂盒的改良产品，含有Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR增强剂、上样染料等所有PCR所需要的成分，用户只需加入粗球孢子菌模板和粗球孢子菌引物即可进行PCR反应，具有广泛的用途。

粗球孢子菌PCR试剂盒

粗球孢子菌PCR试剂盒特点优势：

1.特异性：产品使用的粗球孢子菌引物均经过详尽的生物信息学分析，经过TIANDZ及自建庞大数据库的比对，确保所用的每一条引物均为种属或血清型特异的基因序列区段，可实现对粗球孢子菌特异检测，特异性均达到100%。

2.重现性：粗球孢子菌PCR试剂盒经过大量实验粗球孢子菌株的验证，重现性为100%。

3.灵敏性：粗球孢子菌PCR试剂盒可实现对粗球孢子菌的高灵敏检测，当样品中细菌的浓度达到103cfu/ml时，可实现对其的直接检测，无需繁琐的增菌过程。

4.实用性：检测范围广可实现对临床样品及其他环境取样的快速检测，整个检测过程为3-4个小时。

5.优势1：序列资源丰富，除TIANDZ公布的序列外，从理论上保证所选引物具有良好的保守性和特异性。

6.优势2：粗球孢子菌PCR试剂盒均经过大量的保守性及特异性实验验证，每一种检测试剂盒均经过了20余种标准菌株和临床菌株的保守性验证及40余种近缘标准菌株和临床菌株的特异性验证，确保在使用过程中不会出现任何的假阳性及假阴性报告结果。

应用^[4-5]

粗球孢子菌PCR试剂盒可以用于抗真菌药在体外对棘阿米巴杀伤作用的实验研究

棘阿米巴属Acanthamoeba spp的阿米巴是一种自生生活原虫.广泛分布于土壤、海水、淡水及腐败物等自然环境中,是一种机会致病性原虫。除可引起棘阿米巴性角膜炎(Acanthamoeba Kratits,AK),在免疫功能低下的人群中可引起肉芽肿性阿米巴性脑炎(Granulomatous Aoebic Ecephalitis,GAE)、肺部感染、皮肤病变、鼻窦炎以及弥漫性感染。两性霉素B(amphotericin B)是广谱多烯类抗真菌药。对新型隐球菌、白色念珠菌、芽生菌、荚膜组织胞浆菌、粗球孢子菌、孢子丝菌等有较强抑菌作用,高浓度时有杀菌作用。其作用靶点为细胞膜,与细胞膜表面的麦角蛋白结合,改变细胞膜的通透性,使钾钠渗漏导致细胞死亡。

醋酸卡泊芬净(caspofungin acetate)是一种棘白菌素类抗真菌药,药物作用机制不同于多烯类和唑类,其靶点为细胞壁,能抑制细胞壁中1,3-β-D-葡聚糖的合成。两性霉素B是唯一被确定有抗Naegleria fowleri可米巴临床疗效的药物,但是,对棘阿米巴作用的报道很少。临床上对棘阿米巴有疗效的药物很少,要得到更有效的治疗药物就必须通过相应的实验研究。因此,本学位论文,通过观察数量的改变以及形态结构的变化,分析两性霉素B及卡泊芬净在体外对棘阿米巴的抑制作用。

方法：用生理盐水作为空白对照组,甲硝唑2.0mg/ml为阳性对照组,实验组将棘阿米巴分别用0.1μg/ml、1.0μg/ml、5.0μg/ml、10.0μg/ml浓度的两性霉素B和10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、500μg/ml浓度的卡泊芬净在体外作用4h、8h、24h、48h和72h时,在倒置显微镜下观察棘阿米巴的形态和细胞数量的变化情况。

结果：两性霉素B浓度0.1μg/ml、1.0μg/ml作用4h和8h时与生理盐水空白组比较无明显抑制作用；5.0μg/ml浓度两性霉素B在作用的24h时对棘阿米巴的生长有抑制作用(P<0.05);10μg/ml浓度两性霉素B在作用24h时有明显的抑制作用(P<0.05)；卡泊芬净浓度10μg/ml、50μg/ml作用4h和8h时与生理盐水空白组相比较无明显抑制作用；100μg/ml浓度的卡泊芬净作用72h时对棘阿米巴的生长有抑制作用(P<0.05);500μg/ml浓度的卡泊芬净作用的4h以上有明显的抑制作用(P<0.05)。与甲硝唑阳性对照组相比较,两性霉素B0.1μg/ml作用48h时以上的效果不如甲硝唑；1.0μg/ml两性霉素B作用效果与甲硝唑相近;10.0μg/ml浓度的两性霉素B作用24h的效果明显优于甲硝唑。与甲硝唑阳性对照组相比较,卡泊芬净10μg/ml作用24h时效果不如甲硝唑；50μg/ml、100μg/ml作用效果与甲硝唑相近；500μg/ml作用的4h以上效果明显优于甲硝唑。

结论：两性霉素B10.0μg/ml在体外作用24h以上对棘阿米巴有抑制作用。500μg/ml浓度的卡泊芬净作用的4h以上有明显的抑制作用。10.0μg/ml浓度的两性霉素B作用24h的效果明显优于甲硝唑。500μg/ml浓度的卡泊芬净作用4h以上效果明显优于甲硝唑。

参考文献

[1]Riboflavin and Ultraviolet Light A Therapy as an Adjuvant Treatment for Medically Refractive Acanthamoeba Keratitis.Yasin A.Khan;;Renata T.Kashiwabuchi;;Suy Anne Martins;;Juan M.Castro-Combs;;Sachin Kalyani;;Philip Stanley;;David Flikier;;Ashley Behrens.Ophthalmology,2011

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[5]刘斐.抗真菌药在体外对棘阿米巴杀伤作用的实验研究[D].延边大学,2013.