固相合成醋酸生长激素释放肽-2

背景技术

醋酸生长激素释放肽-2（GHRP）是Momany等人于1984年设计合成的一个含有D型氨基酸的六肽（His-D-Try-Ala-Try-D-Phe-Lys-NH₂），它有较高的促进垂体分泌生长激素GH的活力，却不影响其他垂体激素如TSH、LH、FSH的分泌，而且没有种属特异性，可广谱地促进牛、羊、鸡、猪、猴等动物血清中GH中含量的升高，至今未见有关其毒副作用方面的报导。另外，发现静脉注射醋酸生长激素释放肽-2的效果比皮下注射好；口服醋酸生长激素释放肽-2利用率不高，但也有一定的活性（灵长类对GHRP最为敏感）；鼻腔给药利用率大大提高，为静脉注射的34％-45％，如此高的利用率是其他肽类药物所不能比的，这大概与醋酸生长激素释放肽-2的特殊结构有关，其序列中两个D型氨基酸有效地抑制了蛋白水解酶的识别和降解。这说明醋酸生长激素释放肽-2具有很强的口服或鼻腔内服用潜力，在将来的临床应用中，既可减轻病人的痛苦，也将提供极大的方便。

合成方法

1、氨基酸树脂的制备 

DMF冲洗反应柱，加入0.872g（0.5mmol）的Rink-Amide-AM树脂，加DMF通氮气溶胀30min，抽掉DMF，加入6mL的DBLK溶液脱去树 脂上的Fmoc保护基，氮气吹拂下反应5min，抽干，加入少量DMF洗涤一次，再加入6mL DBLK溶液，氮气吹拂下反应10min，抽干，取少许树脂做茚三酮检测，树脂呈现蓝色，表示Fmoc保护基已脱去，DMF洗涤 三次，DCM洗涤两次。脱保护间隙，将0.958g（2mmol）Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、0.284g（2mmol）HOBt用少量DMF溶解，放置冰浴中，加入0.31ml（2mmol）DIC活化7min。将澄清的氨基酸溶液投入 反应柱内，氮气吹拂下反应2.5h，抽干，加6mL的DMF洗涤两次，抽干，用DCM洗涤一次，抽干，再用DMF洗涤两次。茚检树脂为白色，表示反应完全，制得Fmoc-Lys(Boc)-Rink-Amide-Am树脂。

2、替代度的测定 

精确称取两份干燥的Fmoc-Lys(Boc)-Rink-Amide-Am树脂各10mg，倒入2mL离心管中，标号（1、2），分别加入1mLDBLK溶液，在室温下振摇20min，脱去Fmoc保护基。用移液枪依次从两离心管中各取出200µL溶液至10mL比色管中，标号（1、2），用DMF稀释，摇匀待测。用移液枪取200µL的DBLK溶液至10mL比色管中，用DMF稀释，摇匀，作为空白对照液。紫外分光光度计在301nm处测定两份溶液的吸收值A₁=0.563A，A₂=0.582A。两份Fmoc-Lys(Boc)-Rink-Amide-Am树脂替代度的平均值为Sub=0.469mmol/g。

3、封闭反应 

向反应柱内加入11mL封闭液，封闭20h。用DMF、DCM各交替洗涤三次，抽干，加入8mL甲醇收缩树脂，氮气吹拂5min，抽干，再加8mL甲醇氮气吹拂5min，抽真空至干燥，称量得0.971g。

4、接肽反应（醋酸生长激素释放肽-2树脂的制备） 

称量0.97g（0.45mmol）的Fmoc-Lys(Boc)-Rink-Amide-Am树脂投入反应柱内，加入8mLDMF氮气吹拂下溶胀30min，抽干，加6mL的DBLK溶液脱保护两次（5+7min），抽干，DMF洗涤三次，DCM洗涤两次，茚检，树脂显示深蓝色。在脱保护基间隙，将称量的0.705g（1.8mmol） Fmoc-D-Phe-OH、0.251g（1.8mmol）HOBt用少量DMF溶解，放置冰浴中，加0.28ml（1.8mmol）DIC活化5-7min。将活化好的澄清溶液倒入反应柱内，用少许DMF冲下挂壁的树脂，调整氮气均匀吹拂反应2h，茚检树脂呈白色。抽去反应液，加DMF、DCM交替洗涤三次，每次1min左右。

加6mL的DBLK溶液脱保护2次，一次反应5min，一次反应7min，之间用少量DMF洗涤一次。茚检，树脂显深蓝色，DMF洗涤三次，DCM洗涤两次。将预先配制好的0.948g（1.8mmol）Fmoc-L-Trp(Boc)-OH和 0.264g（1.8mmol）HOBt用少量DMF溶解，放置冰浴中，加0.28ml（1.8mmol）DIC活化5-7min。加至反应柱中，氮气吹拂下反应2h。树脂茚检显白色，DMF洗涤三次，每次1min左右，DCM洗涤两次，抽干。

加6mL DBLK反应5min，DMF洗涤1min，再加DBLK反应7min， 取少量树脂做茚检显深蓝色，DMF、DCM交替洗涤三次。将预先称量好的0.597g（1.8mmol）Fmoc-Ala-OH和0.258g（1.8mmol）HOBt用2mL的DMF溶解，加入0.28ml（1.8mmol）的DIC，冰浴下活化5-7min。将活化好的澄清溶液加至反应柱中，氮气吹拂下反应2.5h。茚检显白色，加 DMF反复洗涤四次，每次1min左右，之间用DCM洗涤一次，抽干。 

加6mL的DBLK溶液脱保护两次（5+7min），DMF洗涤一次。茚检显深蓝色，DMF、DCM交替洗涤三次。将称量好的0.786g（1.8mmol） Fmoc-D-βNal-OH和0.257g（1.8mmol）HOBt倒入烧杯内，用2mL的DMF溶解后，冰浴下加0.28ml（1.8mmol）DIC活化5-7min后加至反应柱中，氮气吹拂反应2h。茚检白色，加DMF反复洗涤三次，DCM洗涤两次，抽干。 

加DBLK溶液脱保护两次，一次反应5min，一次反应7min，之间用DMF洗涤一次。茚检树脂显深蓝色，DMF洗涤三次，DCM洗涤两次。将预先称量好的0.605g（1.8mmol）Fmoc-D-Ala-OH、0.25g（1.8mmol）HOBt用少量DMF溶解，放置冰浴中，加0.28ml（1.8mmol）DIC活化5-7min。加至反应柱中，氮气吹拂下反应2h。取少量树脂做茚检显示白色，抽干，加6mL的DMF洗涤两次，每次1min左右，抽干，用DCM 洗涤一次，抽干，再用DMF洗涤两次。加入6mL的DBLK溶液脱保护反应5min，用DMF洗涤一次，再加DBLK溶液反应7min，DMF洗涤三次。DCM洗涤两次，每次1min，抽干，茚检显紫红色，加入10mL甲醇收缩树脂两次（5+5min），抽真空至恒重。醋酸生长激素释放肽-2树脂称重得1.185g。 

5、醋酸生长激素释放肽-2树脂的切割

从冰柜中取出所用切割试剂，在室温下使TFA、苯甲硫醚、间甲酚等试剂解冻，按体积比配好两种切割配方，放置冰浴中备用。 

切割试剂A：TFA:苯甲硫醚:EDT:苯甲醚（9:0.5:0.3:0.2）；  

切割试剂B：TFA:EDT:间甲酚（9.5:0.4:0.1）; 

称量两份100mg的GHRP-2肽树脂，分别装入2mL的离心管内，标号，用移液枪分别加入1mL切割试剂A、B， 密封，拿冰块包裹控制温度0℃摇振反应0.5h，去除冰袋，放置30℃摇床中继续振荡反应1h。取出离心管，用棉球滤过反应液，滤除树脂，将滤出的液体倒入盛有10ml冰乙醚的离心管中，出现白色絮状沉淀，4000转/min离心机离心3min，倒出上清液，加10mL冰乙醚再次离心，重复三次。最后一次离心后，倒出上清液，抽真空干燥过夜。得到白色固体或淡黄色凝胶状固体即醋酸生长激素释放肽-2粗品。密封，冷藏保存。

6、醋酸生长激素释放肽-2分离纯化

用半制备反相高效液相的纯化条件为：半制备柱Hedera ODS-2反相硅胶柱（20×250mm，10µm）；检测波长215nm；流动相A相： 0.01%TFA/H₂O；B相：CH₃CN；采用梯度洗脱方式：B相25%-55%，洗脱时间30min；流速为8ml/min。取醋酸生长激素释放肽-2粗肽8mg溶于3mL无氧水中，进样，分段收集主峰，减压旋蒸除去微量乙腈、TFA等，预冻一夜，经冷冻干燥得到白色絮状固体醋酸生长激素释放肽-2纯品。

参考文献

[1]郑霄. 生长激素释放肽的固相合成[D].承德医学院,2013.

[2]嘉庆,高立伟.生长激素释放肽的合成及促生长作用研究[J].西南工学院学报,2000(04):26-29.