人乳腺导管癌细胞的应用

背景^[1-3]

人乳腺导管癌细胞是一种人类乳腺癌细胞系，来源于一个乳腺癌患者的乳腺肿瘤组织。这种细胞系最初是由美国国立癌症研究所（National Cancer Institute）的细胞生物学家J.W.Shay于1979年首次建立。BT-549细胞系具有高度浸润性和转移性，能够在体内形成肿瘤并产生远处转移。

人乳腺导管癌细胞来源组织是一个乳头状侵入性导管瘤，7个局部淋巴结中3个已有转移。建立的细胞是多态性的，包括上皮细胞样组分和多核巨细胞。向培养基中分泌黏液素样物质。

人乳腺导管癌细胞

人乳腺导管癌细胞培养步骤：

一．人乳腺导管癌细胞培养基及培养冻存条件准备：

1)准备：DMEM+10%FBS+1%P/S

2)培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3)冻存液：50%basal medium+40%FBS+10%DMSO。

二．人乳腺导管癌细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

注：次传代推荐传代比例为1:2，以后传代比例可根据客户需要自己决定。

3）人乳腺导管癌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

1．细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入2ml完全培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2．1000RPM离心5分钟去掉上清。用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中，注意冻存管做好标识。明舟生物（mingzhoubio）按每个冻存管细胞数目大于1X106个细胞冻存。

3．将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

人乳腺导管癌细胞可以用于转染beclin1对三阴性乳腺癌BT-549细胞EMT过程和化疗敏感性的影响

研究拟通过在三阴性乳腺癌BT-549细胞中过表达beclin1基因,观察Beclin1对TNBC的EMT过程和化疗敏感性等方面的影响,进而探讨通过Beclin1降低TNBC复发和转移及增强化疗敏感性的可能性。

本实验共分二个部分：部分,构建稳定表达beclin1基因的三阴性乳腺癌BT-549细胞系,并研究Beclin1对BT-549细胞EMT过程的影响；第二部分,研究Beclin1对BT-549细胞对化疗药物5-FU和紫杉醇敏感性的影响,并探索相关的机制。

部分beclin1对BT-549细胞的EMT过程的影响目的：构建稳定表达beclin1基因的三阴性乳腺癌BT-549细胞系,并研究Beclin1对BT-549细胞EMT过程的影响,并研究其对BT-549细胞侵袭性和迁移能力的影响。

方法：通过慢病毒转染方法将pLenO-GTP-BECN1真核表达载体导入BT-549细胞构建稳定表达beclin1基因的BT-549细胞系,相同方法构建阴性对照组细胞,经荧光显微镜、real-time PCR和western blot鉴定细胞系为本实验所需；根据载体种类将BT-549细胞分为3组进行实验：pLenO-GTP-BECN1组(目的基因组)、pLenO-GTP组(阴性对照组)和未转染组(空白对照组)；transwell侵袭实验检测各组细胞侵袭能力；transwell迁移实验检测各组细胞迁移能力；real-time PCR和western blot分别检测各组细胞EMT上皮性标志分子E-cadherin和间质性标志分子N-cadherin、Vimentin、Snail表达情况。

结果：慢病毒转染和嘌呤霉素筛选完成后,荧光显微镜下可见pLenO-GTP-BECN1组和pLenO-GTP组BT-549细胞GFP表达显著高于未转染组,real-time PCR和western blot结果显示pLenO-GTP-BECN1组Beclin1mRNA和蛋白表达显著高于其他两组(p<0.01),提示成功构建稳定表达beclin1基因的BT-549细胞系；transwell侵袭实验结果显示,pLenO-GTP-BECN组细胞穿过小室膜的细胞数显著低于其他两组(p<0.01),提示pLenO-GTP-BECN组细胞侵袭性显著降低；transwell迁移实验结果显示,pLenO-GTP-BECN组细胞迁移细胞数较其他两组显著降低(p<0.05),提示pLenO-GTP-BECN组细胞迁移能力显著降低；对于各组细胞EMT标志分子检测结果显示,pLenO-GTP-BECN1组细胞E-cadherin表达显著高于其他两组(p<0.05),而N-cadherin、Vimentin、Snail表达显著降低(p<0.05)。结论：Beclin1可逆转三阴性乳腺癌BT-549细胞EMT过程,并导致细胞侵袭性和迁移能力下降。

第二部分beclin1对BT-549细胞化疗敏感性的影响目的：研究Beclin1对BT-549细胞对化疗药物5-FU和紫杉醇敏感性的影响,并探索相关的机制。

方法：MTT实验检测不同浓度抗肿瘤药物分别作用一定时间对各组BT-549细胞的增殖抑制情况;Annexin V-APC/7-AAD法和Hoechst33342染色法检测50mg/ml5-FU和200μg/L紫杉醇分别处理48h后各组细胞凋亡情况；吖啶橙染色法检测50mg/ml5-FU和200μg/L紫杉醇分别处理48h后各组细胞内自噬性酸性囊泡形成情况；western blot检测50mg/ml5-FU和200μg/L紫杉醇分别处理48h后各组细胞的凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-8和自噬相关蛋白LC3B表达情况。

结果：MTT实验显示,分别接受5-FU和紫杉醇处理时,pLenO-GTP-BECN1组BT-549细胞增殖抑制率均显著高于其他两组(p<0.05)；Annexin V-APC/7-AAD法和Hoechst33342实验显示,化疗药物处理后pLenO-GTP-BECN1组细胞凋亡显著增加(p<0.05),细胞核出现凋亡性变化更明显；吖啶橙染色实验显示,化疗药物处理后pLenO-GTP-BECN1组细胞自噬激活现象较其他两组更明显；western blot实验结果显示,化疗药物处理后pLenO-GTP-BECN1组细胞Caspase-3、Caspase-8和LC3B蛋白表达均显著高于其他两组(p<0.05)。

结论：Beclin1可显著提高三阴性乳腺癌BT-549细胞的化疗敏感性,而其中涉及的机制包括提高三阴性乳腺癌细胞对抗肿瘤药物诱导的凋亡的敏感性、激活过度自噬发生和逆转EMT过程等。

参考文献

[1]Emerging roles of radioresistance in prostate cancer metastasis and radiation therapy.Lei Chang;;Peter H.Graham;;Jingli Hao;;Joseph Bucci;;Paul J.Cozzi;;John H.Kearsley;;Yong Li.Cancer and Metastasis Reviews,2014

[2]Autophagy inhibition suppresses pulmonary metastasis of HCC in mice via impairing anoikis resistance and colonization of HCC cells.Yuan-Fei Peng;;Ying-Hong Shi;;Zhen-Bin Ding;;Ai-Wu Ke;;Cheng-Yu Gu;;Bo Hui;;Jian Zhou;;Shuang-Jian Qiu;;Zhi Dai;;Jia Fan.Autophagy,2013

[3]Breast Cancer Theme Issue:Triple-negative breast cancer and the need for new therapeutic targets.Olav Engebraaten;;Hans Kristian Moen Vollan;;Anne-Lise B?rresen-Dale.The American Journal of Pathology,2013

[4]Protocadherin 17 acts as a tumour suppressor inducing tumour cell apoptosis and autophagy,and is frequently methylated in gastric and colorectal cancers.Xiaotong Hu;;Xinbing Sui;;Lili Li;;Xuefeng Huang;;Rong Rong;;Xianwei Su;;Qinglan Shi;;Lijuan Mo;;Xingsheng Shu;;Yeye Kuang;;Qian Tao;;Chao He.J.Pathol.,2012

[5]范旭龙.转染beclin1对三阴性乳腺癌BT-549细胞EMT过程和化疗敏感性的影响[D].南方医科大学,2015.