支原体检测试剂盒的应用

背景^[1-3]

支原体检测试剂盒是利用Yeasen独特的等温扩增技术开发的针对细胞培养液中支原体污染的快速检测产品，较以往支原体检测产品本试剂盒做了升级改善，在极大程度上降低了假阳性率，提高检测的准确度并增强了阴性和阳性的辨识度。在扩增结束后，可在室温放置一段时间且不会出现由阴性转变为阳性的现象，不影响阴、阳性判断。

支原体检测试剂盒是主要原理是若细胞培养物被支原体污染，支原体DNA的保守序列会被大量、快速地扩增，使反应液由蓝紫色变成天蓝色，结果肉眼可辨，无需电泳。

支原体检测试剂盒可以检测多种支原体，包括细胞培养过程中常见的8种支原体。传统巢式PCR支原体法检测法易受细胞培养上清中抑制物的影响，产生假阴性结果；反应后需开盖电泳检测，增加污染导致的假阳性风险。一步法支原体检测试剂盒完全没有上述缺点，且其检测灵敏度、准确性远远高于PCR法。

支原体检测试剂盒使用方法

1.支原体待检样本准备

贴壁细胞：直接吸取上清。建议在细胞传代或换液3天以上，且汇合度达到90%左右时取样，此时上清中支原体含量较高，便于检出。

悬浮细胞：500 g离心5 min后，吸取上清。建议在细胞传代或换液3天以上时取样，此时支原体含量较高，便于检出。

2.反应体系

将MycAwayTM-Color从-20°C取出，溶解后颠倒混匀，瞬时离心确保所有液体落到管底。根据待检测样品量，配制如下体系（通常实验需要设置阴性对照和阳性对照）

3.加样

待测样品：向其余反应管中加入1μL待测培养上清；

阴性对照：支反应管中不加入任何样品，作为阴性对照；

阳性对照：向最后一个反应管中加入1μL Positive Control，作为阳性对照。

【注】：1)如果反应是在水浴锅中进行，则每管加入20μL矿物油，以防止液体蒸发导致结果的误差。如果反应是在PCR仪中进行，无需加矿物油。

2）实验室支原体污染十分常见，鉴于本试剂盒反应灵敏，建议用户在超净台中配制组分并减少反应后开盖次数，以免出现假阳性结果出现。

4.反应条件

加完样后，先将样品在30℃放置5 min，再在水浴锅或PCR仪中，恒温63°C孵育60 min。

【注】：本试剂盒所用酶对温度非常敏感，强烈建议使用PCR仪操作；如用水浴锅，应先加热使其达到规定温度后再反应。温差超过2°C，将导致扩增效率降低，使阳性反应无法在说明书规定的时间内达到典型的天蓝色。

5.结果判断

63°C反应60 min后，立刻取出反应管，放于室温。在光线良好的环境中观察反应结果（建议以白纸为背景）。如果反应液仍为蓝紫色，则判定为阴性；若反应液为天蓝色，则判定为阳性。

【注】：在63°C反应的时间必须准确计时，超过说明书规定的反应时间可能会出现假阳性。反应管不可开盖，否则会出现气空气中支原体污染反应，出现假阳性的现象。

应用^[4][5]

支原体检测试剂盒可以用于两种鸡滑液囊支原体抗体检测方法的优化与临床应用

研究一方面对MS血清平板凝集方法和检测MS抗体的间接ELISA方法进行优化,另一方面使用SPA试验、HI试验、rMSPB-ELISA试验和商品化ELISA试验对鸡群进行MS感染监测,同时使用支原体检测试剂盒qPCR检测方法对鸡群腭裂拭子进行MS病原监测,目的是探索出稳定、可靠的鸡群MS野毒感染监测方法并针对不同养殖场情况制定相应的MS感染监测计划,从而实现MS感染的快速诊断,这对预防和控制MS感染,阻断MS传播具有重要意义。

1. MS平板凝集试验方法的优化本研究通过对平板凝集抗原的不同制备工艺进行比较,最终筛选出检测效果较好的制备方法。在制备MS血清平板凝集抗原时加入了终浓度为7%牛血清白蛋白以降低SPA试验非特异性反应。将MS阳性血清进行16倍稀释后,与该抗原1:1混合仍能出现肉眼可见的凝集颗粒。保存期试验结果表明SPA抗原在4℃条件下保存12个月仍然有效。

2. 基于重组蛋白rMSPB的MS抗体间接ELISA检测方法的优化本实验室前期通过pET原核表达系统获得了携带His标签的重组蛋白rMSPB,并以该重组蛋白作为包被抗原建立了一种检测MS抗体的间接ELISA方法,但在构建回归方程时相应血清抗体滴度主要依靠商品化试剂盒进行标定,因而将该方法进一步开发为MS检测试剂盒具有一定的局限性。

本研究为了解决以上问题,进而优化试验方案,主要通过PNT基线法来确定不同血清样品的终点滴度,利用减法公式求出不同血清样品在1:500稀释度下的校正吸光度,并将二者进行回归分析,即得在1:500稀释度下S/P值与终点滴度的回归方程Log10(ET)=1.155×Log10(1:500处S/P)+3.661,相关系数(R2)为0.9333。该方法只需对血清样品进行单次稀释即可进行检测,避免了连续倍比稀释产生的误差,并且还降低了试剂成本,提高了检测效率。使用rMSPB-ELISA方法和商品化ELISA方法同时检测临床血清样品并绘制MS抗体消长趋势图,结果表明两种检测方法所测MS抗体滴度的消长趋势保持一致,其中阳性符合率为96.89%,阴性符合率为90.09%。rMSPB-ELISA方法的敏感性为91.44%,特异性为98.20%,与IDEXX商品化试剂盒检测结果基本一致。

3. 三种血清学方法在检测MS抗体中的应用本研究应用SPA试验、HI试验、rMSPB-ELISA方法和商品化MS ELISA抗体检测方法对鸡群进行MS感染监测,同时使用RT-qPCR方法对MS感染情况进行监测。通过对4个不同鸡群的MS抗体和MS病原持续跟踪检测表明,三种血清学方法检测MS抗体整体趋势相同,未感染雏鸡MS抗体效价均呈现先降低,之后随MS野毒感染呈现增高的趋势。在感染初期使用SPA试验可以最先检测出MS抗体,对鸡群进行初步筛查,同时应该利用ELISA检测方法与支原体检测试剂盒对鸡群进行持续监测,根据临床检测结果进一步对规模化养殖场进行MS防控与治疗。

参考文献

[1]Pooled molecular occurrence of Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae in poultry:A systematic review and meta-analysis..ChaidezIbarra Miguel Angel;Velazquez Diana Zuleika;EnriquezVerdugo Idalia;Del Campo Nohemi Castro;RodriguezGaxiola Miguel Angel;MonteroPardo Arnulfo;Diaz Daniel;Gaxiola Soila Maribel.Transboundary and emerging diseases,2021

[2]Clinical expression,epidemiology and monitoring of Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae:an update..Feberwee Anneke;de Wit Sjaak;Dijkman Remco.Avian pathology:journal of the W.V.P.A,2021

[3]Rate of false positive reactions in 11 M.gallisepticum and M.synoviae serological tests in samples obtained from SPF birds inoculated with heterologous mycoplasma species..Feberwee Anneke;;Dijkman Remco;;Wiegel Jeanine;;Ter Veen Christiaan;;Bataille Hanneke;;Bouwstra Ruth;;de Wit Sjaak.Avian pathology:journal of the W.V.P.A,2020

[4]Evaluation of protective efficacy of inactivated Mycoplasma synoviae vaccine with different adjuvants.Xiaowei Gong;;Qiwei Chen;;Naola Ferguson-Noel;;Laszlo Stipkovits;;Susan Szathmary;;Yongsheng Liu;;Fuying Zheng.Veterinary Immunology and Immunopathology,2020

[5]郭婷婷.两种鸡滑液囊支原体抗体检测方法的优化与临床应用[D].扬州大学,2023.