氯化钠蛋白胨缓冲液的应用

背景^[1-3]

氯化钠蛋白胨缓冲液用于药品中细菌的前增菌或样品制备。用途:用于样品制备的营养液。用法称取本品16.1g,加热溶解于1000ml蒸馏水中,分装三角瓶,121℃高压灭菌15分钟备用。

氯化钠蛋白胨缓冲液

氯化钠蛋白胨缓冲液操作步骤:

(一)准确称量试剂:根据不同的菌类和用途,选择适宜的培养基,培养基所需试剂必须纯净。

(二)校正ph值:将称量好的培养基各种成分放入容器内,标记划线,加热溶解,补充水分,测定酸碱度,常用ph6.8~8.0的精密试纸或酸度计测定。用1n NaOH和1n HCL调节ph值到适宜范围内。

(三)过滤:将玻璃漏斗置铁架上,再用纱布夹棉花或用滤纸放在漏斗中,将上述培养基倒入其中过滤至透明。

(四)分装:将过滤后的培养基分装于中试管或三角瓶内(试管内每支装5ml;三角瓶中装100~150ml),塞好棉塞用牛皮纸包扎好,准备灭菌。

(五)灭菌:培养基的灭菌,常用高压蒸汽灭菌法。一般微生物的营养细胞在水中煮沸后即被杀死,但细菌的芽胞有较强的抗热性,须经高压蒸汽灭菌才能达到彻底灭菌的目的。根据蒸汽温度随压力升高而上升的原理,即压力越大,蒸汽温度就越高。因此,在同一温度条件下,采用高压蒸汽灭菌比干热灭菌法效果要好。而且在湿热情况下,菌体吸收水分后,其蛋白质易于凝固变性,因为蒸汽的穿透力强,杀菌效果好。

应用^[4][5]

氯化钠蛋白胨缓冲液可以用于单增李斯特菌快速检测方法研究及致病菌共增菌培养基的研制

由于不同种类致病菌其营养要求不尽相同,前增菌后的样品只能用于单一食源性致病菌的检测,这就极大地限制了高通量检测技术在食源性致病菌检测中的应用。为提升致病菌的检测效率,开发一种能够同时使多种食源性致病菌等速快速增殖的通用增菌培养基是非常有必要的。

本研究部分以单增李斯特菌为目标菌,利用抗体和噬菌体这两种特异性生物识别元件,建立了基于生物膜干涉技术(BLI)的快速检测方法。第二部分研制了一种能使单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌等速快速增殖的通用增菌培养基。

主要研究内容及结果如下:(1)基于BLI技术的单增李斯特菌实时无标记快速检测方法的建立。以抗体为识别元件。探究了第二代氨基偶联传感器表面抗体固定时的相关条件,确定了方法的检出限,分析了方法的特异性。抗体固定化时氯化钠蛋白胨缓冲液的p H为4,抗体固化浓度为50μg/m L。结合时间在3 min、6 min、9min和12min时所对应的单增李斯特菌的最低检出限分别是4.60×104、1.20×104、1.00×104和7.83×103CFU/m L。该方法具有特异性。

(2) 以噬菌体为识别元件。探究了链霉亲和素传感器表面噬菌体固定时的相关条件以及此方法的检出限。修饰噬菌体的生物素化试剂浓度为2%(v/v),噬菌体效价为109PFU/m L。结合时间为3 min、6 min和9 min时,单增李斯特菌检出限分别为3.89×105、2.25×105和1.35×105CFU/m L。

(3) 单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌通用增菌培养基的研制。经过单因素试验挑选出的促进剂和抑制剂,经正交试验进行优化,得出单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌通用增菌培养基(LES)配方:胰胨17 g/L、酵母浸膏6.0 g/L、磷酸氢二钾2.5 g/L、磷酸二氢钾1.35 g/L、磷酸氢二钠9.6 g/L、氯化钠5.0 g/L、蛋白胨3.0 g/L、(月示)蛋白胨25 g/L、牛肉粉15g/L、大豆蛋白胨14 g/L、葡萄糖3 g/L、放线菌酮0.3 g/L、甘露醇3 g/L、丙酮酸钠6 g/L、吖啶黄3 mg/L、磷霉素钠3.125 mg/L。

通过对单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌共增菌培养基的增菌效果进行分析,三种目标菌在LES中培养12 h后菌浓度基本都能够达到107CFU/m L以上,同时抑制非目标菌的生长。增菌后的菌浓度能够满足后续多通道BLI生物传感器、多重PCR、多通道表面等离子体激元共振生物传感器等高通量检测技术的要求。

本研究构建的基于BLI技术的快速检测新方法可实现单增李斯特菌的实时无标记快速检测,所做的探索对于单增李斯特菌以外的其他食源性致病菌的快速检测也有重要指导意义。研制的通用增菌培养基可实现单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌的等速快速增殖,为后续利用多通道生物分子相互作用仪等高通量检测技术同时检测上述三种致病菌打下了基础。

参考文献

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