TRITON-SDS细胞裂解液的应用

背景^[1-3]

TRITON-SDS细胞裂解液由Triton X-100、SDS、Tris-HCl等组成，并含有蛋白酶抑制剂成分，可以有效抑制蛋白的降解，并维持原有的蛋白间相互作用，作用原理是利用Triton X-100破坏脂质双分子层，溶解胞质和细胞膜，破坏分子间微弱结合键的大部分蛋白质抗原，其浓度在0.1%～1%时即可满足几乎所有溶解的需求，且可补充等离子浓度的盐及使pH接近中性，所获得的蛋白质可以用于PAGE电泳，Western，免疫沉淀(Immunol Precipitation，IP)和免疫共沉淀(co-IP)等。不宜用Bradford法测定由Triton-SDS细胞裂解液获得样本的蛋白浓度。

TRITON-SDS细胞裂解液

TRITON-SDS细胞裂解液操作步骤：

一)裂解贴壁培养细胞

1、取TRITON-SDS细胞裂解液置于室温溶解混匀使PMSF终浓度为1mM。

2、去除培养液，低速离心，弃上清。

3、按照6孔板每孔加入150～250μl含有PMSF的裂解液的比例加入riton-SDS Lysis。移液器轻轻吹打，使裂解液和细胞充分接触。置于冰上或4裂解，通常裂解1～3s内，细胞就会被裂解。

4、离心(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。

5、进行后续的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

二)裂解悬浮培养细胞

1、取TRITON-SDS细胞裂解液置于室温溶解混匀后加入PMSF，使PMSF终浓度为1mM。

2、低速离心悬浮细胞，弃上清，收集沉淀。

3、用手指轻弹细胞，使其松散。按照6孔板每孔细胞加入150～250μl含有PMSF的TRITON-SDS细胞裂解液。

4、离心(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。

5、进行后续的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

三)裂解组织样本

1、取TRITON-SDS细胞裂解液置于室温溶解混匀后加入PMSF，使PMSF终浓度为1mM。

2、把组织剪切成细小的碎片，越小越好。

3、取在液氮或超低温冰箱中冷冻以上的组织，迅速用液氮研磨，研磨过程尽量控制在1～2min之内，以减少蛋白的降解。

4、按照每20mg组织加入150～250μl裂解液的比例加入含有PMSF的裂解液。冰上或4裂解。

5、离心(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。

6、进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

应用^[4][5]

TRITON-SDS细胞裂解液可以用于p53诱导基因Unc5H4在神经母细胞瘤发生发展的作用机制

1、细胞培养:人骨肉瘤来源U2OS及SAOS2细胞系在DMEM培养液中培养,人肺癌细胞系H1299及人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y均在RPMI1640培养液中培养。培养基中含有10%热灭火胎牛血清,50U/ml青霉素及50μg/ml链霉素;细胞在37℃、5%CO2平衡浓度的细胞培养箱中培养,当细胞单层生长融合率至80%时传代或进行实验。在实验所设计的时间段用终浓度1μmol/L阿霉素的相应培养基换液处理。

2、质粒转染:采用脂质体Lipofectamine2000介导转染技术,在H1299细胞中转染入p53质粒或对照空质粒;在U2OS细胞中转染入siRNAp53质粒或空质粒;在H1299细胞中转入PGL3—p53结合区质粒和p53质粒,转染方法参照相关转染试剂说明步骤。

3、细胞生存分析:将U2OS、H1299及SH-SY5Y细胞以5×103个细胞/孔分别接种于96孔板中,贴壁过夜,然后暴露于终浓度1μmol/L阿霉素中。在阿霉素处理后的指定时间内,加入10μl染色剂,在37℃培养箱内反应1hr,然后放入酶标仪,读取570nm波长下的O.D.值。

4、RT-PCR:参照试剂盒使用方法,在实验细胞中通过RNessy Mini Kit提取总RNA,并用随机引物和SuperScriptⅡ逆转录酶得到cDNA。经PCR扩增的链来检验目的基因的表达水平。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离后,用溴乙锭显色。

5、蛋白质检测(Western-blotting):收集细胞经冷1×PBS液清洗后在TRITON-SDS细胞裂解液(10%glycerol,5%β-mercaptoethanol,2.3%SDS,62.5 mmol/LTris·HCl pH 6.8)。再用蛋白检测染液测定蛋白浓度,相同蛋白含量的TRITON-SDS细胞裂解液加样于10%SDS聚丙烯酰胺电泳分离后,转移至PVDF膜,用含0.3%脱脂牛奶的TBS封闭非特异吸附,分别加入一抗抗体室温作用1hr,洗膜,并用相应二抗作用,在ECL系统显色。

6、克隆构建实验:在U2OS和H1299细胞中转染入空质粒(pcDNA3)或Unct5H4表达质粒(pcDNA3-Unct5H4)48小时后,用400μg/ml G418的培养基进行14天筛选,耐药克隆用Giemsa染液染色,记录克隆数目。

7、荧光素酶检测法:H1299细胞以5×104细胞/孔接种于12孔板中贴壁过夜。转染体系包括100ng PGL3—启动子质粒,p53-RE1,p53-RE2,p53-RE3及p53-RE4,10ng Renilla荧光素酶标记结构及25ng p53-flag表达质粒。每一份转染所包含的质粒数为510ng,不足处以pcDNA3质粒填充,转染48小时后,裂解细胞并应用双色荧光素酶检测系统进行荧光素酶活性的检测,具体步骤参照试剂盒说明。

8、染色质免疫沉淀分析法:在H1299细胞中转染空质粒或p53表达质粒,转染48小时后细胞在37℃条件下与含1%甲醛的培养液进行交联反应,得到交联的染色质后超声将其断裂为平均长度为200-800的核苷片段,应用脱氧核糖核酸/蛋白质A琼脂糖珠加以反复清洗后,对照使用正常鼠血清、实验组使用单克隆抗p53抗体进行免疫沉降。沉降物用100μl洗提掖(含1%SDS和1mM碳酸氢钠)洗提。甲醛介导的脱氧核糖核酸/蛋白质交联在65℃加热4小时条件下失效,反应物在45℃下蛋白酶K作用1小时。应用QIAquickPCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化基因组DNA。

9、流式细胞仪检测凋亡:转染#1和#3的SAOS2细胞,应用1μmol/L ADR处理48小时,收集包括悬浮细胞在内的全部细胞。PBS清洗,-20℃70%酒精固定细胞,悬浮于phosphate—citrate液中,室温放置15分钟,Propidium Iodido使检DNA染色,并10μg/ml Rnase A抑制RNA酶作用,暗处反应30分钟,流式细胞仪检测细胞DNA含量并应用CellQuest软件处理数据。

参考文献

[1]The dependence receptor hypothesis.P.Mehlen;D.E.Bredesen.APOPTOSIS,2004

[2]The RET receptor:function in development and dysfunction in congenital malformation.Serge Manié;;Massimo Santoro;;Alfredo Fusco;;Marc Billaud.Trends in Genetics,2001

[3]Netrin‐1 acts as a survival factor via its receptors UNC5H and DCC.Fabien Llambi;;Frédéric Causeret;;Evelyne Bloch‐Gallego;;Patrick Mehlen.The EMBO Journal,2001

[4]Neurotrophin dependence domain.Shahrooz Rabizadeh;;Xin Ye;;Sabina Sperandio;;James J.L.Wang;;H.Michael Ellerby;;Lisa M.Ellerby;;Christopher Giza;;Rebecca L.Andrusiak;;Harald Frankowski;;Yifah Yaron;;N.Nicole Moayeri;;Giorgio Rovelli;;Christopher J.Evans;;Larry L.Butcher;;Garry P.Nolan;;Nuria Assa-Munt;;Dale E.Bredesen.Journal of Molecular Neuroscience,2000

[5]王弘.p53诱导基因Unc5H4在神经母细胞瘤发生发展的作用机制[D].中国医科大学,2008.