兔骨髓间充质干细胞的应用

背景^[1-3]

兔骨髓间充质干细胞（BMSC）是一种存在于兔骨髓基质系统中的干细胞，具有高度自我更新能力和多向分化潜能。这种干细胞可以向骨、软骨、肌组织、皮肤、脂肪、神经等多种组织分化，因此可以作为组织工程中的种子细胞。

兔骨髓间充质干细胞的分离和体外培养要求较高的条件，如贴壁时间、种植密度、血清含量、培养温度和培养基pH值等。在普诺赛实验室，采用冲洗骨髓、密度梯度离心、差速贴壁法结合培养基筛选的方法，可以获得兔骨髓间充质干细胞，细胞总量约为5×10⁵cells/瓶。

兔骨髓间充质干细胞的纯度可以通过CD90免疫荧光鉴定达到90%以上，并且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。这种干细胞的保存和培养需要在特定的培养条件下进行，如培养温度保持在37℃，使用含有10%胎牛血清的DMEM培养基等。

兔骨髓间充质干细胞（BMSC）

兔骨髓间充质干细胞处理：

1）冻存细胞的复苏：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2）兔骨髓间充质干细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。

3.轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3）兔骨髓间充质干细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

下面T25瓶为例；

1.细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×106~1×107个活细胞/ml.

2.1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞，按每1ml冻存液含1×106~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

3.将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。

应用^[4][5]

兔骨髓间充质干细胞可以用于兔骨髓间充质干细胞体外构建血管化组织工程心肌的实验研究

利用兔骨髓间充质干细胞作为种子细胞,分别诱导为心肌样细胞和内皮细胞,于体外构建血管化组织工程心肌组织,为临床上通过组织工程与细胞移植技术治疗心肌梗死这一疾病提供理论基础和技术支持。

方法1选取普通级日本大耳白兔,无菌分离双侧股骨及胫骨,采用Percoll分离液分离兔骨髓间充质干细胞并使用流式细胞仪鉴定其表面标志物CD90、CD105和CD45。使用内皮细胞条件培养基(Endothelial cell culture medium,ECM)对兔骨髓间充质干细胞诱导为内皮细胞,采用免疫细胞化学染色的方法对表面标志物CD34和CD31进行鉴定。显微镜下观察兔骨髓间充质干细胞和内皮细胞的形态学变化。

2使用5-氮胞苷对兔骨髓间充质干细胞定向诱导为心肌样细胞,免疫细胞化学染色的方法对表面标志物心肌肌钙蛋白T(Cardiac troponin T,c TNT)进行鉴定,并于显微镜下观察诱导后细胞的形态学变化。

3分别使用4,6-二氨基-2-苯基吲哚(4,6-diamino-2-phenylindole,DAPI)和氯甲基苯甲酰氨(Chloromethylbenzamidodialkylcarbocyanine,CM-DIL)标记心肌样细胞和内皮细胞。

4将诱导后获得的心肌样细胞与内皮细胞按照不同比例进行共培养(1∶0、0∶1、1∶1、1∶2)。

5将不同组的细胞接种至Matrigel基质胶和胶原海绵两种支架材料上,观察细胞-支架材料复合物的血管化形成能力。

6采用SPSS 23.0统计软件对实验数据进行统计学分析,计量资料使用均数±标准差(sx±)的形式表示,多个样本的均数之间的比较采用单因素方差分析,以P<0.05表示具有显著性差异。采用Graph Pad Prism 8.0软件进行图形的绘制。

结果1通过流式细胞仪技术检测可观察到使用Percoll分离液的方法可获得兔骨髓间充质干细胞,CD90和CD105表面标志物呈现为阳性表达,CD45为阴性表达,显微镜下可观察到48小时的兔骨髓间充质干细胞形态为透亮圆形、折光性较强,第1代的兔骨髓间充质干细胞,细胞长短伸展不一,形态多为短梭形,内含少量杂质细胞,第2代的兔骨髓间充质干细胞,细胞呈现为梭形,第3代的兔骨髓间充质干细胞,细胞体积较起始细胞体积大,形态变为长梭形,多边形。

参考文献

[1]Electroactive graphene composite scaffolds for cardiac tissue engineering.Pamela Hitscherich;;Ashish Aphale;;Richard Gordan;;Ricardo Whitaker;;Prabhakar Singh;;Lai‐hua Xie;;Prabir Patra;;Eun Jung Lee.Journal of Biomedical Materials Research Part A,2018

[2]Different Sources of Stem Cells and their Application in Cartilage Tissue Engineering.Quanquan Ma;;Jinfeng Liao;;Xiaoxiao Cai.Current Stem Cell Research&Therapy,2018

[3]Transplantation of CREG modified embryonic stem cells improves cardiac function after myocardial infarction in mice.Jian Zhang;;Xiaoxiang Tian;;Chengfei Peng;;Chenghui Yan;;Yang Li;;Mingyu Sun;;Jian Kang;;Erhe Gao;;Yaling Han.Biochemical and Biophysical Research Communicatio,2018

[4]Advances in osteobiologic materials for bone substitutes.Anwarul Hasan;;Batzaya Byambaa;;Mahboob Morshed;;Mohammad Ibrahim Cheikh;;Rana Abdul Shakoor;;Tanvir Mustafy;;Hany E.Marei.Journal of Tissue Engineering and Regenerative Me,2018

[5]韩刘君.兔骨髓间充质干细胞体外构建血管化组织工程心肌的实验研究[D].华北理工大学,2021.