大鼠海马神经元细胞的应用

背景^[1-3]

大鼠海马神经元细胞是指从正常胎鼠脑中分离出来的海马神经元细胞，具有参与近期记忆、情绪和内脏功能调节等重要功能。这些细胞可以从海马体中分离出来，进行体外培养，作为研究神经细胞生物学特性和外源性干扰因子影响的有效细胞模型。

大鼠海马神经元细胞的分离和培养过程需要维持在无菌的环境中，并且需要提供适宜的营养和生长因子，以保证细胞的生长和发育。这些细胞可以通过免疫荧光技术进行鉴定和纯度检测，如MAP2和tau1免疫荧光染色等。

大鼠海马神经元细胞可以用于研究神经元的发育、再生和修复，以及神经退行性疾病、神经元损伤等方面的研究。此外，这些细胞还可以用于药物筛选和肿瘤治疗的研究，如抗癫痫药物、抗肿瘤药物和基因治疗等。

大鼠海马神经元细胞

大鼠海马神经元细胞培养步骤：

一．大鼠海马神经元细胞培养基及培养冻存条件准备：

1)准备：DMEM+10%FBS+1%P/S

2)培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3)冻存液：50%basal medium+40%FBS+10%DMSO。

二．大鼠海马神经元细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

注：次传代推荐传代比例为1:2，以后传代比例可根据客户需要自己决定。

3）大鼠海马神经元细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

应用^[4][5]

大鼠海马神经元细胞可以用于siRNA干扰CRMP1对大鼠海马神经元突起生长和细胞骨架的影响

探讨坍塌反应调节蛋白1(Collapsin response mediator protein 1,CRMP1)对大鼠海马神经元突起生长和细胞骨架的影响。

材料和方法：化学合成3对靶向大鼠海马神经元CRMP1基因的siRNA,通过RT-PCR与实时荧光定量PCR筛选干扰CRMP1表达的siRNA,并用免疫细胞荧光和Western blot检测CRMP1的表达,然后合成5’端标记FAM绿色荧光基团筛选后的siRNA序列,阳离子脂质体转染原代培养大鼠海马神经元,荧光显微镜下观察绿色荧光在神经元内的表达部位并定时追踪神经元突起的生长,共聚焦显微镜观察α-tubulin、CRMP5蛋白的重排与分布,蛋白印记检测α-tubulin、CRMP5蛋白的表达量。

结果：(1)转染效率的检测：阳离子脂质体法将FAM标记的阴性对照siRNA瞬时转染大鼠海马神经元,流式细胞仪检测转染效率为52.5%。

(2) CRMP1-siRNA的筛选：化学合成3对针对CRMP1基因的siRNAs序列,通过RT-PCR、实时荧光定量PCR、免疫细胞荧光和Western blot成功筛选出1对有效siRNA,其中CRMP1-249 siRNA能有效抑制CRMP1 mRAN的表达,抑制效率达84.3%,蛋白表达下降了22.4%。

(3) CRMP1-siRNA在细胞内分布：转染CRMP1-249 siRNA后,FAM标记的有效siRNA绿色荧光主要分布于神经元胞体、突起和生长锥。

(4) 细胞生长追踪结果：转染CRMP1-249 siRNA 6h后开始追踪神经元生长过程,发现32 h后CRMP1-249组神经元细胞形态发生明显改变,胞体开始坍塌,突起出现回缩,一级突起与二级突起数量及长度较空白对照组有统计学差异(P<0.05)；48 h后细胞裂解死亡。

(5) 共聚焦显微镜观察与蛋白印记检测结果：α-tubulin、CRMP5蛋白主要分布于神经元胞体、突起以及生长锥,实验组抗原荧光强度明显弱于对照组。蛋白印记检测结果显示α-tubulin、CRMP5蛋白的表达量分别下降了47.7%和53%,较空白对照组有统计学差异(P<0.05)。

结论：(1)成功筛选出1对有效干扰CRMP1基因的siRNA。

(2) siRNA抑制CRMP1后,神经元胞体与突起回缩塌陷,细胞裂解死亡,说明抑制CRMP1不能促进突起生长并可导致神经元死亡。

(3) α-tubulin、CRMP5表达于海马神经元的胞体、突起和生长锥。

(4)抑制CRMP1表达使α-tubulin与CRMP5蛋白表达明显减少。

参考文献

[1]Fascin:A key regulator of cytoskeletal dynamics.Asier Jayo;;Maddy Parsons.International Journal of Biochemistry and Cell Biology,2010

[2]Activation of ADF/cofilin mediates attractive growth cone turning toward nerve growth factor and netrin‐1.Bonnie M.Marsick;Kevin C.Flynn;MiguelSantiago‐Medina;James R.Bamburg;Paul C.Letourneau.Devel Neurobio,2010

[3]Axon Growth and Guidance:Receptor Regulation and Signal Transduction.Michael O'Donnell;Rebecca K.Chance;Greg J.Bashaw.Annual Review of Neuroscience,2009

[4]Structure and Dynamics of the Actin Filament.Jim Pfaendtner;;Edward Lyman;;Thomas D.Pollard;;Gregory A.Voth.Journal of Molecular Biology,2009

[5]张忠其.siRNA干扰CRMP1对大鼠海马神经元突起生长和细胞骨架的影响[D].暨南大学,2011.