德舍瑞林的制备与纯化

背景技术

德舍瑞林又称LHRH-Hydrogel implant，RL0903，分子式是:C₆₄H₈₃N₁₇O₁₂，分子量是：1282.47，结构式如图所示。德舍瑞林是一种人工合成的九肽，用于治疗中枢性性早熟症。德舍瑞林是一种促黄体激素释放激素(LHRH)激动剂,美国学者Shore等报告，对于晚期前列腺癌患者，每年一次给予德舍瑞林长效埋植剂皮下埋植，能长期稳定地抑制睾酮，使其保持去势水平。

现有的合成方法中，纯固相方法合成中需要使用大量的昂贵的多肽树脂，这给企业的大规模生产带来了成本的压力，不仅如此，在最后切肽的工序中，叔丁基很容易在酸性条件下被脱除，将生成其他杂质产物。而且每一次脱保护均需用三氟乙酸，故三废污染多，多次连接氨基酸，成肽收率低，生产成本高，限制了德舍瑞林的大规模生产和应用。

制备方法

1)取150g 2-氯三苯甲基氯树脂，用1000ml二氯甲烷浸泡，使树脂充分溶胀，再取91.1g芴甲氧羰基保护脯氨酸，用1000ml接肽试剂溶解，加入反应器，20-25℃反应15小时后吹干，分别用N，N-二甲基甲酰胺和甲醇洗涤吹干，获得芴甲氧羰基保护脯氨酸2-氯三苯甲基氯树脂;

2)以步骤1)所述的芴甲氧羰基保护脯氨酸2-氯三苯甲基氯树脂为被接物，按照徳舍瑞林9肽序列，从脯氨酸端依次接入精氨酸、亮氨酸、色氨酸、酪氨酸、丝氨酸、色氨酸、组氨酸和焦谷氨酸；每次接入前，向被接物中加1000ml脱保护试剂,室温下反应15分钟，吹干，分别用NN-二甲基甲酰胺和甲醇洗涤3次，吹干，再取540mmol接入物，用173.4g O-(苯并三唑-1-氧)-N,N,N,N-四甲基脲鎓六氟硼酸盐，72.9g 1-羟基苯并三唑，用1000ml接肽试剂溶解，加入反应器，20-25℃反应15h，吹干后再分别用N,N-二甲基甲酰胺和甲醇洗涤3次，吹干，接完焦谷氨酸后获得9肽树脂；

3)将512.3g步骤2)所的9肽树脂转移至5000ml的容器中，加入3500ml预先配制好的体积比为1:99的三氟乙酸和二氯甲烷中反应2.5小时，过滤，收集滤液，将滤液减压蒸馏，获得361.2g全保护的9肽片段；

4)将26.1g 1-羟基苯并三唑和27.2g乙胺盐酸盐加入到512.3g步骤3)所得全保护的9肽片段中，再加入39ml二异丙基碳二亚胺，20-25℃下反应24h，减压蒸馏，获得全保护的德舍瑞林片段；

5)向步骤4)所得的全保护的德舍瑞林片段中加入到3500ml预冷至0-10℃的切肽试剂，反应2-3小时，加入10000ml乙醚沉淀，收集沉淀物，用乙醚淋洗3次，真空干燥，获得德舍瑞林粗品。

纯化方法

德舍瑞林粗产品的纯化：此过程共分为4个步骤:样品前处理、纯化、冻干、包装

1、样品前处理

PH调整：使用稀TFA水溶液调整PH在1.0-3.5之间过滤：使用直径=300mm、孔径=0.45um微孔滤膜过滤

2、纯化条件

2.1制备柱：15cm X 30cm 柱 Kromasil 10um C18 反相色谱填料颗粒

2.2流动相：A:0.1%TFA水溶液 B:ACN

2.3上样

平衡：用约2个柱体积5%B流动相，平衡柱子 10 分钟上样量：5g目的肽

上样流速：250ml/min

检测波长：230nm同时监测压强

2.4收样

执行梯度洗脱，当主峰流出时开始收集馏分，直到检测器吸光度小于0.1AU时或者主峰流出后达到主要拐点时停止。同时用反向 HPLC监测各馏分纯度。本方法得到的产品纯度达到98.0%以上纯度。

2.5浓缩：通过旋转蒸发仪浓缩馏分；

3、冻干：冻干盘使用大铁盘(厚度<1cm)预冻时间，在冷阱中预冻7h以上冷冻干燥机冻干；

4、包装：冻干成干粉后，分装于洁净容器内。

参考文献

[1] 江苏诺泰生物制药股份有限公司. 一种德舍瑞林的合成方法:CN201510735214.8[P]. 2016-01-20. 

[2] 安徽瀚海博兴生物技术有限公司. 一种徳舍瑞林的合成方法:CN201410184663.3[P]. 2014-08-27.