NCI-H157人非小细胞肺腺癌贴壁细胞系的应用

背景^[1-3]

NCI-H157人非小细胞肺腺癌贴壁细胞系是一种人非小细胞肺腺癌贴壁细胞系，源自一位肺癌患者的肿瘤组织。该细胞系在生长培养基中表现出贴壁生长的特性，细胞形态以多角形为主。推荐使用RPMI-1640培养基＋10%FBS＋1%P/S进行培养，培养条件为气相：空气，95%；CO₂，5%；温度：37℃。推荐传代比例为1:2-1:3，推荐换液频率为2~3次/周。

NCI-H157人非小细胞肺腺癌贴壁细胞系

NCI-H157人非小细胞肺腺癌贴壁细胞系培养操作

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）NCI-H157人非小细胞肺腺癌贴壁细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）NCI-H157人非小细胞肺腺癌贴壁细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；

1.细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

NCI-H157人非小细胞肺腺癌贴壁细胞系可以用于地衣活性化合物赤星衣酸乙酯的抗癌药效及作用机制研究

分离鉴定地衣的抗癌活性化合物,研究其对人癌细胞株的体外抗癌作用,观察其体外抗癌作用是否具有细胞靶向性和选择性,以及抗癌作用的剂量-效应关系和时间-效应关系,了解活性化合物与临床抗癌药物顺铂联合抗癌作用的形式以及作用强度。采用动物体内抗癌实验研究活性化合物对裸鼠移植人宫颈癌Hela的体内抗癌作用,同时观察活性化合物对动物的可能毒性作用。对活性化合物进行基因芯片和流式细胞仪检测分析,从基因水平和细胞水平研究活性化合物对癌细胞基因表达和癌细胞周期分布的影响,探讨活性化合物抗癌作用的机制。

[方法]1.采用醇提、醇沉和氯仿萃取等分离手段得到抗癌活性成分AMH-D。

2. 对活性成分进行柱层析法分离,结合体外抗癌活性追踪检测,获得抗癌活性化合物G。

3. 将活性化合物G进行纯度检测,并进行质谱、核磁共振氢谱、核磁共振碳谱及dept谱检测,由专家进行化学结构的解析。

4. 采用MTT法检测活性化合物G对HepG2、XWLC-05、A-549、MCF-7、T-24、NCI-H157、NCI-H460、CNE及BEAS-2B的细胞体外抑制作用,观察其剂量-效应关系及敏感性差异,了解活性化合物G对癌细胞与正常细胞作用的差别及抗癌作用的选择性;对A-549进行时间-效应关系的检测。

5. 采用金氏公式检测活性化合物G与顺铂联合抗癌作用的形式及强度,观察其剂量-效应关系。

6. 通过Babl/c裸鼠移植人宫颈癌Hela实验进行体内抗癌研究,观察活性化合物对Hela移植瘤生长的影响。

7. 采用流式细胞仪技术检测活性化合物G对癌细胞周期分布的影响,从细胞水平探讨活性化合物G对癌细胞抑制作用机制。

8. 采用基因芯片方法检测活性化合物G对癌细胞基因表达的影响,发现活性化合物显著性影响的基因、通路及功能。

[结果]1.本次从该地衣中分离得到了一个具有抗癌作用活性化合物G。

2. 该活性化合物纯度为97.448%。

3. 该活性化合物相对分子质量为224.1,分子式为C11H12O5,为已知结构化合物,中文名称为赤星衣酸乙酯。

参考文献

[1]Effects of genetic variants in SLC22A2 organic cation transporter 2 and SLC47A1 multidrug and toxin extrusion 1 transporter on cisplatin-induced adverse events.Kazufumi Iwata;;Keiji Aizawa;;Saori Kamitsu;;Sachiko Jingami;;Eiko Fukunaga;;Minoru Yoshida;;Misato Yoshimura;;Akinobu Hamada;;Hideyuki Saito.Clinical and Experimental Nephrology,2012

[2]Unstable Angina Associated With Cisplatin and Carboplatin in a Patient With Advanced Melanoma.Shaheer Khan;;Carol L.Chen;;Mary S.Brady;;Rekha Parameswaran;;Russell Moore;;Hani Hassoun;;Richard D.Carvajal.Journal of Clinical Oncology,2012

[3]Involvement of oxidative stress in taxol-induced apoptosis in chronic myelogenous leukemia K562 cells.Azadeh Meshkini;;Razieh Yazdanparast.Experimental and Toxicologic Pathology,2010

[4]Role of satellite cell-derived l-serine in the dorsal root ganglion in paclitaxel-induced painful peripheral neuropathy.T.Kiya;;T.Kawamata;;A.Namiki;;M.Yamakage.Neuroscience,2011

[5]姜重阳.地衣活性化合物赤星衣酸乙酯的抗癌药效及作用机制研究[D].昆明医科大学,2018.