SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳次高分子量标准蛋白质的应用

背景^[1-3]

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳次高分子量标准蛋白质试剂为测定未知蛋白质分子量的标准参照样品，分子量范围为43,000-200,000>道尔顿，特别适用于测定分子量在100,000-200,000>道尔顿的蛋白质。

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）作为聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的一种，可测定蛋白质的分子量，对蛋白质组分进行分离、分析、纯化、定性、定量以及少量的制备。在蛋白表达中有着广泛应用，尤其是在大肠杆菌表达系统中，有着不可替代的作用。

利用SDS-PAGE电泳方法或毛细管电泳法（CE-SDS）提供了最简单、成本最低，并且在确定样品中蛋白质组分数目方面灵敏度最高的手段，因此最为常用。SDS凝胶电泳以及利用电泳测定分子质量和大小的方法。这个方法都可以单独测定样品的纯度，方法的选择取决于希望检测待测蛋白质的何种性质。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳次高分子量标准蛋白质试剂

对于SDS-PAGE，由于在电泳体系中加入了十二烷基硫酸钠（SDS）和强还原剂（如巯基乙醇，二硫苏糖醇等），其中SDS作为阴离子去污剂会破坏蛋白质的氢键和疏水相互作用，导致蛋白质构象改变，而巯基乙醇等可以打开蛋白质分子内的二硫键，使其分解为亚基，因此电泳过程中蛋白质的生物活性丧失或减弱，但电泳后可恢复或部分恢复其活性。

在离子强度低时，主要以单体形式存在的SDS可以与蛋白质结合，生成蛋白质-SDS复合物。由于SDS带有大量负电荷，复合物所带的负电荷远远超过蛋白质原有的负电荷，这使得不同蛋白质间电荷的差异被掩盖。而SDS-蛋白质复合物形状都呈椭圆棒形，棒的长度与蛋白质亚基分子量有关，所以在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白只存在分子大小的差别，利用这一点可将不同的蛋白质分开（分子筛效应），因此SDS-PAGE常用于检测蛋白质亚基的分子量及鉴定纯度。

与常规PAGE类似，不连续SDS-PAGE对蛋白质的分离除了基于分子筛效应外，还基于其对样品的浓缩效应。

实验步骤

1、制胶：根据蛋白样品的大小制不同浓度的胶，蛋白分子量小就要制高浓度的胶，分子量大的蛋白就制低浓度的胶，制不同厚度的胶所需的浓缩胶和分离胶体积也不一样。

2、加样、电泳：过稍许时间等胶凝固后把SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳次高分子量标准蛋白质marker和所需的鉴定的蛋白和标准品蛋白（如BSA）经处理后加到加样孔中，倒入电泳缓冲液接通电源开始跑胶。

3、染色、脱色：等示踪染料溴酚蓝跑至胶末端，关闭电源，去除浓缩胶后，将分离胶放入考马斯亮蓝染色液中染色40分钟，然后放入脱色液中脱色1小时，并换脱色液2-3次。

4、结果：根据SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳次高分子量标准蛋白质Marker（或者蛋白标准品的相对迁移率制作的标准曲线）判断蛋白大小，根据有无杂带判定蛋白的纯度。根据BSA标准品条带的灰度制作标曲，并计算出目的蛋白的相应浓度。

应用^[4-5]

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳次高分子量标准蛋白质可以用于杂交油菜品种纯度聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定方法的研究

研究在前人关于作物种子纯度鉴定研究的基础上,研究了酯酶同工酶电泳、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、醋酸-PAGE、乳酸-PAGE、甲酸-PAGE等电泳方法对杂交油菜种子纯度鉴定的影响,并进行了品种真实性和种子纯度的验证性试验和扫描电镜分析。主要研究结果如下:

1.选用不同油菜品种、油菜杂交种及其亲本,培育不同发育时期幼苗(萌发0d,1d,3d,5d,7d),提取酯酶同工酶,进行电泳。由电泳图谱观察发现,3d-5d芽龄的幼苗是利用酯酶同工酶电泳鉴定品种真实性和种子纯度的最适宜时期。

2.研究了碱性电泳缓冲系统在杂交油菜品种真实性及种子纯度鉴定中的应用。分析了油菜清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白等四类蛋白质的SDS-PAGE电泳图谱,探索适合杂交油菜种品种鉴定的蛋白质电泳系统;分析了分离胶浓度,浓缩胶浓度,离子强度,电极缓冲液浓度等对电泳效果的影响;经多次试验分析,本试验选择分离胶浓度10%,浓缩胶浓度3%,碱性电极缓冲液pH8.3的组合进行蛋白质电泳,此组合电泳图谱较为清晰,效果较好。应用上述方法对8个杂交油菜组合的干种子进行了分析。

结果表明,四类主要蛋白质在品种间均存在不同程度的谱带差异,均可较好区分不同的杂交油菜品种,其中碱性体系谷蛋白的多态性较强,图谱清晰度较高,鉴定杂交油菜品种真实性和种子纯度的效果更好。

3. 利用醋酸-PAGE、乳酸-PAGE、甲酸-PAGE三种酸性电泳缓冲系统,油菜清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白等四类蛋白电泳对杂交油菜品种真实性和种子纯度进行鉴定。结果表明,多数酸性电泳缓冲系统的酶谱效果较差,但在醋酸-PAGE缓冲系统条件下,清蛋白多态性较强,鉴定杂交油菜品种的效果相对较好。酸性电泳缓冲系统虽然比较稳定,但其酶谱效果明显不如碱性体系的蛋白质电泳。

4.为了探讨室内谷蛋白SDS-PAGE电泳检测与田间纯度的关系,选择8个杂交油菜品种,通过田间种植试验与实验室杂交种种子纯度谷蛋白的SDS-PAGE电泳检测验证性试验结果进行相关分析。结果表明,田检纯度和蛋白质电泳图谱纯度呈极显著正相关r=0.8587(r2=0.7373),建立了田间纯度依谷蛋白SDS-PAGE电泳谱带纯度的回归方程:Y=0.6988X+28.992。

参考文献

[1]Gel electrophoresis for the identification of plant varieties.Robert J.Cooke.Journal of Chromatography A,1995

[2]The use of seed acid phosphatases in the determination of the purity of F1hybrid brussels sprout seed.S.Woods;;D.A.Thurman.Euphytica,1976

[3]Protein electrophoresis as an aid to oat variety identification.R.S.Singh;;S.K.Jain;;C.O.Qualset.Euphytica,1973

[4]Electrophoretic study on seed proteins of maize hybrids and inbreds.Wang Hong-Xin,Niu Zhan-Qi,Hu Zhi-Ang.Chinese J Bot.1989

[5]王鹤鹃.杂交油菜品种纯度聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定方法的研究[D].安徽农业大学,2009.