NR8383的应用

背景^[1-3]

NR8383来源于肺灌洗时的正常大鼠肺泡巨噬细胞。NR8383细胞在gerbil肺细胞连续培养液存在下培养了大约8-9个月。随后，不再需要外源生长因子。通过有限稀释法从单个细胞克隆并亚克隆NR8383细胞，并三次用软琼脂亚克隆。

NR8383细胞表现出巨噬细胞的特性，吞噬酵母多糖和铜绿，非特异性脂酶活性，Fc受体，氧化降解；分泌IL-1,TGF-β和IL-6，可重复地响应外源生长因子。NR8383细胞响应博莱霉素，分泌TGF-β前体。在博莱霉素刺激下，TGF–βmRNA表达也上升。

NR8383细胞对内毒素敏感。1-10钠克/毫升的LPS水平抑制增生达50%。即使达到0.001毫克/毫升的水平，LPS抑制还是无毒且在后续过程中可逆的。NR8383细胞株提供了高响应的肺泡巨噬细胞的均一来源，可以用于体外研究巨响细胞相关活性。

NR8383

一．NR8383培养基及培养冻存条件准备：

1)准备F12K培养基(推荐：iCell-0007)，优质胎牛血清15%，GlutaMAX-1谷氨酰胺(iCell-0900)1%，P/S 1%

2）NR8383培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

3）NR8383冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二．NR8383细胞处理：

1）冻存细胞的复苏：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达70%-90%，即可进行传代培养。

该细胞轻微贴壁和悬浮培养的细胞，传代可以参考以下方法：

1.收集：将培养瓶中的悬浮的细胞收集到离心管中。用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。由于细胞贴壁不牢PBS润洗后细胞会脱落所以PBS也要回收到离心管中。

2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL）置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。

3.将收集到的悬浮细胞、pbs清洗液中的细胞和消化下来的贴壁细胞以1000rpml离心5min，弃去上清，补加1-2mL培养液后重悬混匀后将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3）NR8383细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

应用^[4-5]

NR8383可以用于大鼠肺泡巨噬细胞ERG钾通道的表达及其功能的初步研究

目的:1.观察肺泡巨噬细胞上是否有ERG钾通道的表达。2.初步探讨ERG钾通道与该细胞的分泌及吞噬功能是否相关。

方法1.大鼠肺泡巨噬细胞ERG钾通道的表达以大鼠肺泡巨噬细胞系NR8383为研究对象,人肺腺癌细胞系A549为阴性对照,采用RT-PCR方法检测NR8383细胞erg钾通道mRNA的表达,RT-PCR产物进行cDNA测序验证;免疫细胞化学方法和Western blot检测NR8383细胞膜上ERG钾通道蛋白的表达。

2. LPS刺激后大鼠肺泡巨噬细胞系NR8383细胞erg mRNA和蛋白的表达变化将培养24h的NR8383细胞系,加入LPS 1ug/ml刺激(正常对照组细胞不加),分别于3h、6h、12h、24h提取细胞总RNA和总蛋白采用RT-PCR法和Western-blot法检测ERG钾通道表达的变化。

3. 阻断ERG钾通道后大鼠肺泡巨噬细胞吞噬和分泌功能的变化将细胞分为正常对照组、4-AP阻断组、TEA阻断组、E-4031阻断组。后三组先以相应浓度(分别为1mM、mM、5μM)作用于细胞,阻断钾通道,2h后和正常对照组一起加入制备好的5%鸡红细胞,使鸡红细胞与大鼠肺泡巨噬细胞的比例大概为100:1,置于培养箱中孵育1h。之后用4%的多聚甲醛固定,再行姬姆萨染色,油镜下观察100个AM,计算吞噬率。吞噬率=已吞噬的巨噬细胞数/巨噬细胞总数×100%。放射免疫法检测阻断ERG钾通道后LPS刺激肺泡巨噬细胞分泌炎症因子IL-6的变化,将细胞分为PBS对照组、LPS组、4-AP+LPS组(非特异阻断组)、TEA+LPS组(非特异阻断组)、E-4031(1μM)+LPS组(特异阻断组)、E-4031(5μM)+LPS组(特异阻断组);每组设6个孔。阻断钾通道2h后与LPS组一起加LPS 1ug/ml刺激24h。24h后收集上清,采用放射免疫法检测各组上清液中IL-6的分泌量。

结果1.RT-PCR及测序结果表明,检测到480bp左右的片段(与预期的一致),表明NR8383细胞有erg mRNA表达,阴性对照A549细胞未见erg mRNA表达。经cDNA测序进一步证实其序列与数据库中序列完全吻合。免疫细胞化学染色显示,大量棕黄色阳性颗粒分布在NR8383细胞膜上,表明NR8383细胞膜上有ERG钾通道蛋白表达,而阴性对照的A549细胞膜上未见棕黄色颗粒。Western blot可以在NR8383细胞蛋白提取物中检测到155kDa和135kDa两条特异的ERG蛋白条带,而阴性对照A549细胞未检测到相应条带。

2. LPS刺激肺泡巨噬细胞后,ERG钾通道mRNA水平和蛋白水平的表达变化

半定量RT-PCR检测不同时间点LPS刺激后erg mRNA表达水平的改变,结果显示:与未经LPS刺激的AM细胞相比,经LPS刺激后6h组erg mRNA表达明显增强,呈明显时间依赖性增加,至所观察的24h组达到最高,为对照组的2倍(P<0.05)。

参考文献

[1]Mitochondrial reactive oxygen species mediate hypoxic down-regulation of hERG channel protein.Jayasri Nanduri;;Ning Wang;;Pamela Bergson;;Guoxiang Yuan;;Eckhard Ficker;;Nanduri R.Prabhakar.Biochemical and Biophysical Research Communications,2008

[2]hKv1.5 channels play a pivotal role in the functions of human alveolar macrophages.Seon-Ah Park;;Yong-Chul Lee;;Tian-Ze Ma;;Jeong-Ah Park;;Myung-Kwan Han;;Hwang-Ho Lee;;Hwan-Gyu Kim;;Yong-Geun Kwak.Biochemical and Biophysical Research Communications,2006

[3]Modulation of the Cardiac Sodium Channel NaV1.5 by Fyn,a Src Family Tyrosine Kinase.Christopher A.Ahern;;Ji-Fang Zhang;;Marilyn J.Wookalis;;Richard Horn.Circulation Research,2005

[4]The potent inhibitory effects of cisapride,a specific blocker for human ether-a-go-go-related gene(HERG)channel,on gastric cancer cells.Xiao-Dong Shao;;Kaichun Wu;;Zhi-Ming Hao;;Liu Hong;;Jiang Zhang;;Daiming Fan.Cancer Biology&Therapy,2005

[5]董海莹.大鼠肺泡巨噬细胞ERG钾通道的表达及其功能的初步研究[D].第三军医大学,2010.