SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳低分子量标准蛋白质的应用

背景^[1-3]

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳低分子量标准蛋白质是一种用来确定蛋白质分子量大小的工具。它通常由一系列已知分子量的蛋白质混合物组成，这些蛋白质的分子量范围通常在10kDa到97kDa之间。

在进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳时，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳低分子量标准蛋白质可以作为参照，帮助确定待测蛋白质的分子量。在电泳后，可以通过比较SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳低分子量标准蛋白质和待测蛋白质在凝胶上的相对位置来确定待测蛋白质的分子量。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳低分子量标准蛋白质

聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术，用于分离蛋白质和寡核苷酸。

聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵（APS）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。

PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCl。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCl。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。

实验步骤

1、制胶：根据蛋白样品的大小制不同浓度的胶，蛋白分子量小就要制高浓度的胶，分子量大的蛋白就制低浓度的胶，制不同厚度的胶所需的浓缩胶和分离胶体积也不一样。

2、加样、电泳：过稍许时间等胶凝固后把SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳低分子量标准蛋白质marker和所需的鉴定的蛋白和标准品蛋白（如BSA）经处理后加到加样孔中，倒入电泳缓冲液接通电源开始跑胶。

3、染色、脱色：等示踪染料溴酚蓝跑至胶末端，关闭电源，去除浓缩胶后，将分离胶放入考马斯亮蓝染色液中染色40分钟，然后放入脱色液中脱色1小时，并换脱色液2-3次。

4、结果：根据SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳低分子量标准蛋白质Marker（或者蛋白标准品的相对迁移率制作的标准曲线）判断蛋白大小，根据有无杂带判定蛋白的纯度。根据BSA标准品条带的灰度制作标曲，并计算出目的蛋白的相应浓度。

应用^[4-5]

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳低分子量标准蛋白质可以用于基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的核酸适配子—血清结合分析及其在肝癌诊断中的应用

将在前期工作基础上,首先建立基于聚丙烯酰胺凝胶电泳及灰度分析的适配子与血清结合程度分析方法,然后通过该方法分析一组肝癌血清适配子对肝癌的诊断价值,以期建立基于适配了的肝癌诊断新方法。

方法:(1)血清标本收集:收集原发性肝癌、乙型病毒性肝炎、肝硬化病人和参加体检且各项检查均正常的健康人的血清标本,-80℃保存备用。

(2) 基于聚丙烯酿胺凝胶电泳及灰度分析的适配子与血清结合程度分析方法建立及血清标本检测:人工合成适配子并用结合缓冲液配成适配子溶液;将最小量为2pmol的等差梯度适配子量进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳、GelRed染色、适配子带灰度测定,以确定适配子的合适用量;将合适用量的适配子与最小量为2μl的等差梯度肝癌混合血清量孵育后进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳、GelRed染色、游离适配子带灰度测定,以确定血清标本的合适用量;以合适用量的适配子与合适用量的血清标本孵育后进行12%聚丙烯酰胺凝胶和GelRed染色,测定游离适配子带的原始灰度指标(灰度、框选面积、平均灰度、标准差和平均背景),并计算衍生灰度指标(灰度比值、信噪比、平均净灰度和变异系数)。

(3)数据统计及诊断价值分析:通过单因素方差分析检验肝癌与非肝癌(亚)组间各适配子灰度相关指标差异的统计学意义;将各项灰度相关指标分别进行受试者工作特征(ROC)曲线分析,获取各指标诊断肝癌的曲线下面积(AUC)和诊断界值,并据后者计算各适配子的各灰度相关指标对肝癌的诊断效能(敏感度、特异度、准确度、预测值和似然比);对各适配子的灰度相关指标分别进行多因素Logistic逐步回归分析,建立基于多项灰度指标的数学诊断模型,据此获得各标本的组别概率值(即综合灰度指标)并进行ROC曲线分析,获得其诊断肝癌的AUC和诊断界值,并据后者计算各适配子综合灰度指标对肝癌的诊断效能;将各适配子的单项灰度相关指标和/或综合灰度指标分别进行多因素Logistic逐步回归分析,建立基于多个适配子的数学诊断模型,据此获得各标本的组别概率值并进行ROC曲线分析,获取诊断肝癌的AUC及诊断界值,计算诊断效能;对各适配子的综合灰度指标与AFP对肝癌的诊断价值进行比较。

参考文献

[1]Serological AFP/Golgi protein 73 could be a new diagnostic parameter of hepatic diseases.Liyuan Tian;;Yu Wang;;Dabin Xu;;Junhao Gui;;Xingwang Jia;;Hongli Tong;;Xinyu Wen;;Zhennan Dong;;Yaping Tian.Int.J.Cancer,2011

[2]Estimates of worldwide burden of cancer in 2008:GLOBOCAN 2008.JacquesFerlay;Hai‐RimShin;FreddieBray;DavidForman;ColinMathers;Donald MaxwellParkin.Int.J.Cancer,2010

[3]Des-γ-Carboxy Prothrombin andα-Fetoprotein as Biomarkers for the Early Detection of Hepatocellular Carcinoma.Anna S.Lok;;Richard K.Sterling;;James E.Everhart;;Elizabeth C.Wright;;John C.Hoefs;;Adrian M.Di Bisceglie;;Timothy R.Morgan;;Hae–Young Kim;;William M.Lee;;Herbert L.Bonkovsky;;Jules L.Dienstag.Gastroenterology,2010

[4]Serum immunoreactivity of SMP30 and its tissues expression in hepatocellular carcinoma.Su-Fang Zhou;;Fa-Rong Mo;;Ye-Hong Bin;;Gang-Qiang Hou;;Xiao-Xun Xie;;Guo-Rong Luo.Clinical Biochemistry,2010

[5]徐国峰.基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的核酸适配子—血清结合分析及其在肝癌诊断中的应用[D].南昌大学,2019.