MKN45的应用

背景^[1-3]

MKN45是一种人胃癌细胞，经过STR鉴定合格，由S.Akiyama建立，源于一位35岁患有印戒细胞癌的女性患者的胃淋巴结。该细胞系具有贴壁和悬浮两种生长方式，适应在RPMI-1640培养基中生长，并需要添加10%FBS。MKN45细胞的形态类似于淋巴母细胞，并且能够通过酶消化法或机械方法从培养容器表面解离下来进行传代。

MKN45

需要注意的是，不同批次和来源的MKN45细胞存在差异，因此需要严格按照说明书进行操作，并进行必要的细胞鉴定和质量控制。此外，MKN45细胞系也被广泛用于构建裸鼠胃癌模型，对于研究胃癌的发生、发展、治疗和预后等方面具有重要的意义。

MKN45细胞的培养：

1）准备RPMI-1640培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2）MKN45培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）MKN45冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

MKN45细胞处理：

1）冻存细胞的复苏：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达70%-90%，即可进行传代培养。

该细胞为悬浮和轻微的贴壁细胞，传代可以参考以下方法：

1.收集：将培养瓶中的悬浮的细胞收集到离心管中。用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。由于细胞贴壁不牢PBS润洗后细胞会脱落所以PBS也要回收到离心管中。

2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL）置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。

3.将收集到的悬浮细胞、pbs清洗液中的细胞和消化下来的贴壁细胞以1000rpml离心5min，弃去上清，补加1-2mL培养液后重悬混匀后将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3）MKN45细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

应用^[4-5]

MKN45可以用于AKR7A3抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭及其机制研究

研究分析AKR7A3在胃癌中的临床意义;探讨AKR7A3表达对胃癌细胞生物学功能和行为的影响,并初步阐明AKR7A3参与胃癌发生发展的分子机制。为探讨胃癌的诊断、分子机理以及靶向治疗候选分子的筛选提供有价值的参考和依据。

方法:1、q RT-PCR、Western Blot以及免疫组织化学技术分析胃癌肿瘤组织和配对癌旁胃粘膜组织中AKR7A3表达水平,并分析AKR7A3表达与胃癌临床病理参数之间的关系。q RT-PCR和Western Blot分别检测四种不同人源胃癌细胞株(AGS、SGC7901、BGC823、MKN45)中AKR7A3的m RNA和蛋白相对表达水平。

2、采用脂质体法,将真核表达载体pc DNA3.1-AKR7A3和空载体pc DNA3.1转染SGC7901和AGS胃癌细胞;将AKR7A3特异sh RNA载体和阴性对照载体,转染MKN45胃癌细胞,G418筛选稳定克隆株。q RT-PCR和Western Blot检测AKR7A3在转染细胞系及亲本细胞中的表达。Ed U增殖、细胞平板克隆形成以及Transwell迁移侵袭实验,分析过表达AKR7A3对SGC7901和AGS胃癌细胞增殖、克隆形成、迁移侵袭能力的影响;同时分析干扰AKR7A3表达后对MKN45胃癌细胞的增殖、克隆形成、迁移侵袭能力的影响。裸鼠皮下成瘤实验检测过表达AKR7A3后,SGC7901胃癌细胞体内成瘤能力的变化。

3、免疫组织化学技术检测胃癌肿瘤组织和配对癌旁胃粘膜组织中β-catenin表达,并分析胃癌组织中β-catenin表达与AKR7A3表达的相关性。q RT-PCR、Western Blot和激光共聚焦实验检测过表达AKR7A3和干扰AKR7A3表达对细胞内总β-catenin、核β-catenin及下游靶基因C-myc、Cyclin D1、Survivin表达水平的影响。利用蛋白质合成抑制剂放线菌酮(Cycloheximide,CHX),阻断β-catenin的合成,动态观察0-4小时内β-catenin的变化,探讨过表达AKR7A3对β-catenin稳定性的影响。利用26S蛋白酶体抑制剂MG132,阻断蛋白质降解,观察过表达AKR7A3对细胞中β-catenin降解方式的影响。Western Blot检测过表达AKR7A3和干扰AKR7A3表达后细胞内E3泛素连接酶β-Tr CP的表达情况。

4、实验结果和数据利用SPSS 26.0软件和Graph Pad Prism 8.0软件进行统计分析。

结果:1、AKR7A3在胃癌组织和胃癌细胞系中表达下调。

(1) AKR7A3在胃癌组织中的表达明显低于配对癌旁胃粘膜组织。免疫组织化学还发现AKR7A3的表达下调与胃癌患者淋巴结转移和TNM分期正相关。

(2) AKR7A3在四种不同人源胃癌细胞株(SGC7901、AGS、BGC823、MKN45)中的表达都明显低于癌旁胃粘膜组织。但MKN45细胞中AKR7A3的表达明显高于SGC7901和AGS细胞。

2、AKR7A3抑制胃癌细胞增殖、克隆形成、迁移侵袭和体内肿瘤生成。

(1) 脂质体转染,G418筛选,获得稳定的亚克隆细胞SGC7901-pc DNA3.1-AKR7A3、AGS-pc DNA3.1-AKR7A3、SGC7901-pc DNA3.1、AGS-pc DNA3.1、MKN45-Sh AKR7A3-1,2、MKN45-Sh CON。而且,相对于pc DNA3.1和亲本细胞,pc DNA3.1-AKR7A3细胞中AKR7A3的m RNA和蛋白水平都明显上调;相对于Sh CON和亲本细胞,MKN45-Sh AKR7A3-1,2细胞AKR7A3的m RNA和蛋白水平都减少。

(2) 过表达AKR7A3对SGC7901和AGS细胞增殖、克隆形成、迁移侵袭有明显的抑制作用;相反,敲降AKR7A3对MKN45胃癌细胞增殖、克隆形成、迁移侵袭能力有增加趋势。

(3)体内裸鼠成瘤模型提示过表达AKR7A3对SGC7901胃癌细胞体内成瘤能力有明显的抑制作用。

参考文献

[1]Glucocorticoids regulate AKR1D1 activity in human liver in vitro and in vivo..Nikolaou Nikolaos;;Arvaniti Anastasia;;Appanna Nathan;;Sharp Anna;;Hughes Beverly A;;Digweed Dena;;Whitaker Martin J;;Ross Richard;;Arlt Wiebke;;Penning Trevor M;;Morris Karen;;George Sherly;;Keevil Brian G;;Hodson Leanne;;Gathercole Laura L;;Tomlinson Jeremy W.The Journal of endocrinology,2020

[2]The Physiology of the Gastric Parietal Cell..Engevik Amy C;;Kaji Izumi;;Goldenring James R.Physiological reviews,2020

[3]Global burden of cancer attributable to infections in 2018:a worldwide incidence analysis.Catherine de Martel;;Damien Georges;;Freddie Bray;;Jacques Ferlay;;Gary M Clifford.The Lancet Global Health,2020

[4]Identification of key genes for predicting colorectal cancer prognosis by integrated bioinformatics analysis..Dai Gong-Peng;;Wang Li-Ping;;Wen Yu-Qing;;Ren Xue-Qun;;Zuo Shu-Guang.Oncology letters,2020

[5]李艳兰.AKR7A3抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭及其机制研究[D].南华大学,2022.