大鼠回肠细胞的应用

背景^[1-3]

大鼠回肠细胞是一种来源于大鼠肠上皮细胞的细胞，形态为上皮细胞样，贴壁生长。该细胞污染支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性。

大鼠回肠细胞

大鼠回肠细胞培养操作规程：

一．大鼠回肠细胞培养基及培养冻存条件准备：

1）准备DMEM培养基(DMEM，GIBCO，货号11995-065)，95%；优质胎牛血清，5%，添加0.1U/ml胰岛素。

2）大鼠回肠细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

3）大鼠回肠细胞冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

二．大鼠回肠细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）大鼠回肠细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3ml此细胞的培养基终止消化。

3.轻轻吹打后吸出，移入15ml离心管中，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养液后吹匀。

4.移入到事先准备好的含有5ml培养基的T-25培养瓶中或含有14ml培养基的T-75培养瓶中培养。

3）大鼠回肠细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，先要消化处理并进行细胞计数。消化方法按照细胞传代方法的1-3步骤进行，最后的重悬液使用血清。悬浮细胞直接计数后离心，用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中。

应用^[4][5]

大鼠回肠细胞可以用于肠上皮γ-氨基丁酸能信号通路调节小肠液分泌及其作用机制

观察GABA能信号系统是否在小肠组织表达,尤其是在参与液体分泌的上皮细胞上的表达情况；探讨GABA能信号系统在肠粘膜上皮表达的生理意义。

方法：RT-PCR(反转录聚合酶链反应)无菌条件下,将IEC-18(a cell line derived from the ileum of rat intestine)细胞种植于直径为10cm的圆形培养皿中；待细胞浓度增殖达到90%以上时,用4℃预冷的磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline,PBS)冲洗细胞三次,加入Trizol试剂提取细胞RNA。健康成年雄性Wistar大鼠脱颈牺牲后,小心取出大脑组织,用4℃预冷的PBS冲洗3次,剥离出新鲜大脑皮质,剪碎后,加入Trizol提取组织RNA。按照反转录试剂盒的说明,提取细胞和组织的cDNA;然后用GABAA受体各亚单位和GAD65/67的引物通过PCR扩增得到相应的DNA。再用DNA凝胶电泳观察各目的带表达情况。

免疫组织化学石蜡切片染色步骤：将新鲜动物组织用4%多聚甲醛(PFA)固定液浸泡24小时后,将组织脱水并用石蜡包埋后切片(组织厚度：4-5μm),依次进行脱蜡、水化和抗原修复处理。用10%与二抗来源相同的血清室温条件下封闭切片1小时后,加入一抗,4℃环境下孵育过夜。PBS冲洗切片3次,每次5分钟,加入荧光标记的二抗室温避光孵育1小时。PBS冲洗3次,每次5分钟,75%甘油缓冲液封片,荧光显微镜观察拍片。

细胞免疫染色步骤：将IEC-18细胞种植在10%多聚赖氨酸(PDL)包被的盖玻片上,培养48小时,待细胞贴壁良好后,室温条件下,用4%多聚甲醛迅速固定10分钟,PBS冲洗三次,每次5分钟,其余步骤同石蜡切片染色。Western Blot将新鲜组织或细胞匀浆后,4℃离心(12000g)10分钟,取离心后的上清液进行蛋白定量。用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)下层胶和5%的上层分离胶电泳,湿转方法将蛋白转移至孔径为0.45微米的PVDF(Polyvinylidene Fluoride)膜上,5%脱脂牛奶室温封闭PVDF膜1小时,加入一抗覆盖PVDF膜,4℃孵育过夜。用1倍的TTBS冲洗PVDF膜3次,每次10分钟。室温下加入辣根过氧化酶标记的二抗孵育1小时。用1倍TTBS冲洗3次,每次10分钟,ECL显影。膜片钳记录实验将IEC-18细胞种植在10%多聚赖氨酸包被的盖玻片上,24小时后待细胞贴壁,开始全细胞记录。记录时用正常细胞外液(155mM NaC1、1.3mM CaC12,5.4mM KC1、25mM HEPES和33mM葡萄糖(pH7.4,渗透压315mosmol/kgH2O))常温循环灌流细胞,用700B放大器进行记录。

记录电极内液为155mM KC1、15mM KOH、10mM HEPES、2mM MgC12、1mM CaC12、10mM EGTA和2mM Tetraethylammonium(pH7.35,渗透压315mosmol/kgH20)o电压钳记录时,将细胞膜电位钳制在-60mV。信号采集后用低通滤波器(1-2kH)进行滤波处理。

在体小肠液分泌实验成年雄性BALB/c小鼠,体重在25-30克之间,实验前禁食,自由饮水。用2%戊巴比妥钠(45-50mg/kg)腹腔注射麻醉动物,固定四肢和头部,在恒温条件下(36℃-38℃)行开腹手术。在距离盲肠1-2cm处结扎回肠,沿向心端方向量取2cm回肠进行结扎,使之形成长约2cm的回肠襻,用直径为0.33mm的胰岛注射器向肠襻内注射100μ1的生理盐水或药物,确保无渗漏后依次关闭腹腔各层。待动物苏醒后给予鼠粮和饮水。5小时后,脱颈牺牲小鼠,取出回肠襻,量取回肠襻的长度和称取去除肠液前后的肠襻重量,进行统计分析。

统计分析小肠液分泌试验中,用去除肠液前后重量差除以回肠襻的长度(g/cm)作为观察指标,比较对照组和处理组之间有无统计学差异。所有数据采用均数±标准误(Mean±SEM)表示,用单因素方差分析进行统计学处理,以P<0.05作为显著性差异界值。

参考文献

[1]Laboratorial characteristics of patients with diarrhoea suffering from egg white allergy.F.Liu;;L.-R.Lin;;H.-L.Zhang;;G.-L.Liu;;M.-L.Tong;;Y.-L.Zeng;;S.-J.Huang;;C.-L.Huang;;L.-L.Liu;;T.-C.Yang.Allergologia et Immunopathologia,2013

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[3]Beyond Skin Testing:State of the Art and New Horizons in Food Allergy Diagnostic Testing.Jean-Christoph Caubet;;Hugh A.Sampson.Immunology and Allergy Clinics of North America,2012

[4]Targeting IL-4/IL-13 signaling to alleviate oral allergen–induced diarrhea.Eric B.Brandt;;Ariel Munitz;;Tatyana Orekov;;Melissa K.Mingler;;Melissa McBride;;Fred D.Finkelman;;Marc E.Rothenberg.The Journal of Allergy and Clinical Immunology,2009

[5]李妍.肠上皮γ-氨基丁酸能信号通路调节小肠液分泌及其作用机制[D].山东大学,2014.