组织线粒体分离试剂盒的应用

背景^[1-3]

组织线粒体分离试剂盒可用于快速便捷分离组织/细胞线粒体，获得的线粒体纯度较高，且绝大部分都含有完整的内膜和外膜，可用于线粒体的生理功能等方面的研究，得到的线粒体也可被相应裂解液裂解得到线粒体蛋白，从而用于后续SDS-PAGE、Western、双向电泳及免疫共沉淀等分析。

组织线粒体分离试剂盒

线粒体是绝大多数真核细胞内的一种基本的重要的细胞器，是细胞的动力工厂，细胞进行氧化磷酸化的场所。因此，对线粒体进行分离，以此为对象，对线粒体呼吸作用、mtDNA、mtRNA以及其他线粒体蛋白性能分析等具有重要意义。

组织线粒体分离试剂盒使用方法

1线粒体的抽提

1）样本处理

①组织匀浆：称取100-200mg新鲜组织，PBS或生理盐水冲洗干净，滤纸吸干，用剪刀剪成非常小的碎块放入小容量玻璃匀浆器内。加入1-2.5mL冰预冷的试剂A，混匀，孵育8-10min，匀浆10-30下左右，也可采用超声方法破膜。

②培养细胞匀浆：消化细胞，PBS洗涤，800 g离心5-10 min收集细胞。计数，每次提取需要1-5×107个细胞，加入1-2.5mL预冷的试剂A，重悬细胞，混匀，孵育8-10min，可以采用超声或匀浆器方法破膜。

2）将组织或细胞匀浆物转移到离心管，4℃，800 g离心5 min。

【注】：细胞核、大的膜碎片、未裂解细胞等沉淀在管底。

3）收集上清液并转移到新的离心管。4 ℃，800 g再次离心5 min。弃沉淀。

4）将上清液转移到新的离心管。4℃，12,000×g离心10 min，小心去除上清，沉淀即为分离得到的细胞线粒体。

【注】：离心后的上清含胞浆成分，尽量除去上清。

2线粒体蛋白的抽提

1）向每毫升预冷试剂B加入10μL试剂C混匀。冰上保存数分钟待用。

2）按每10μL线粒体压积中，加入100μL上述配制好的试剂B/C溶液。

3）置于4℃旋涡振荡15-30 min。

4）10,000rpm，4℃离心15min，取上清，即为线粒体全蛋白提取物，进行蛋白定量。

5）分装保存于-70℃，避免反复冻融。

应用^[4][5]

组织线粒体分离试剂盒可以用于猪PGC-1α、线粒体相关基因组织表达及Leptin对PGC-1α、UCPs mRNA表达的影响

线粒体是细胞内重要的亚细胞器,普遍存在于真核细胞中,其通过呼吸作用将糖、蛋白、脂类等生物大分子物质氧化分解,释放ATP,为机体提供能量。目前研究表明,线粒体不仅与能量代谢密切相关,而且其也是影响肉质嫩度及风味的一个重要因素没,本研究以猪为实验动物：

(1) 利用RT-PCR方法分析线粒体相关基因PGC-1α、UCP2、UCP3、Cyt-c、CPT-Ⅰ组织差异表达特点;

(2) 建立了猪骨骼肌卫星细胞的分离培养体系;(3)研究外源Leptin对猪成肌细胞中PGC-1α、UCPs mRNA表达的影响。

结论:1.PGC-1α基因进行组织分布研究发现:心脏、肝脏、肌肉、肺脏、肾脏、脾脏、皮下脂肪和内脏脂肪中均有的PGC-1αmRNA表达,其中心脏、肝脏、肌肉的表达丰度最高,UCP2基因在、肌肉、皮下脂肪、肾脏、脾脏、内脏脂肪中均有表达,在心脏、肺中没有检测到表达,其中肾脏表达丰度最高,在肌肉中次之,肝脏中的表达量最低。而内脏脂肪和皮下脂肪中UCP2基因mRNA表达丰度差异不显著。UCP3基因在肌肉、皮下脂肪、内脏脂肪中均有表达,在其他几个组织中均没有检测到表达,肌肉、皮下脂肪、内脏脂肪UCP3基因mRNA表达丰度差异不显著。Cyt-c基因在心脏、肝脏、肌肉、皮下脂肪、肾脏、脾脏、内脏脂肪、脾脏和肺中均有表达,其中心脏中表达最高,肝脏、肌肉表达次之。CPT-Ⅰ基因mRNA在心脏、肝脏、肌肉、皮下脂肪、肾脏、脾脏、内脏脂肪、脾脏和肺中均有表达,其中肝脏中表达最高,心脏、肾脏、脾脏镖达次之,而皮下脂肪的表达量高于肌肉(P<0.05)。

2. 用链酶蛋白酶、胰酶、胶原酶分别消化骨骼肌组织块,结果表明,链酶蛋白酶消化所获得的肌卫星细胞数显著高于胰酶和胶原酶。在一定的消化时间内,胶原酶消化的效果较差,消化物中含大量的肌束,所获得肌卫星细胞数量很少。三种酶消化所得细胞活率无显著差异。用Desmin抗体及ABC染液进行间接免疫酶染色,RT-PCR方法检测MyoG和MyoD的表达,结果显示链酶蛋白酶消化所得肌卫星细胞95%呈阳性反应,培养7天后MyoG和MyoD均有表达,说明分离得到是肌卫星细胞。

3. 半定量RT-PCR分析结果表明,30和100 nmol/L的Leptin均可促进PGC-1a转录,100 nmol/L Leptin处理12 h后可促进PGC-1αmRNA表达;处理24 h后,PGC-1αmRNA水平显著高于对照组(p<0.05)。30 nmol/L处理24 h后可提高PGC-1αmRNA水平,但其促进效果明显低于100 nmol/L处理组(p<0.05)。半定量RT-PCR分析结果表明,30 nmol/L Leptin可明显提高成肌细胞中UCP2mRNA的表达,处理12和24 h后UCP2mRNA水平显著高于对照组,且作用24 h促进效果明显优于12 h处理效果(p<0.05),100 nmol/L Leptin提高成肌细胞中UCP2mRNA的表达,处理12和24 h后UCP2mRNA水平显著高于对照组,但作用效果显著低于12和24 h后30 nmol/L Leptin作用效果(p<0.05)。30和100 nmol/L Leptin在时间上和剂量上,均不影响UCP3mRNA水平表达水平(p<0.05)。

综上所述,线粒体相关基因表达存在明显的组织差异性,PGC-1a在富含线粒体的组织中表达较高,表明其与线粒体发育存在明显相关。其它基因根据组织能量需求及代谢特点不同而表达有所差异。外源添加不同浓度的Leptin显著影响PGC-1α和UCP表达,提示leptin可通过调控线粒体而影响机体能量代谢。

参考文献

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[2]Transcriptional coactivator PGC-1αcontrols the energy state and contractile function of cardiac muscle.Zoltan Arany;;Huamei He;;Jiandie Lin;;Kirsten Hoyer;;Christoph Handschin;;Okan Toka;;Ferhaan Ahmad;;Takashi Matsui;;Sherry Chin;;Pei-Hsuan Wu;;Igor I.Rybkin;;John M.Shelton;;Monia Manieri;;Saverio Cinti;;Frederick J.Schoen;;Rhonda Bassel-Duby;;Anthony Rosenzweig;;Joanne S.Ingwall;;Bruce M.Spiegelman.Cell Metabolism,2005

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[5]文旭辉.猪PGC-1α、线粒体相关基因组织表达及Leptin对PGC-1α、UCPs mRNA表达的影响[D].西北农林科技大学,2007.