NCI-H1703人肺腺鳞癌贴壁细胞系的应用

背景^[1-3]

NCI-H1703人肺腺鳞癌贴壁细胞系是于1987年建系，源自一位54岁患有非小细胞肺癌的白人男性，该患者为吸烟者。

NCI-H1703人肺腺鳞癌贴壁细胞系

NCI-H1703人肺腺鳞癌贴壁细胞系培养步骤：

1）复苏NCI-H1703人肺腺鳞癌贴壁细胞系细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）NCI-H1703人肺腺鳞癌贴壁细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1、对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

2、对于悬浮细胞，传代可参考以下方法：

方法一：收集细胞，1000RPM条件下离心8-10分钟，弃上清液，补加1-2ml培养液后吹匀，将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或瓶中。

方法二：可选择半数换液方式，弃半数培养基后，将剩余细胞悬起，将细胞悬液按1:2到1:3的比例分到新的含8ml培养基新皿中或者瓶中。

1）NCI-H1703人肺腺鳞癌贴壁细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。弃培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，进行离心收集，1000RPM条件下离心8-10分钟，去除上清，按冻存数量加入到冻存液中。

应用^[4][5]

NCI-H1703人肺腺鳞癌贴壁细胞系可以用于组蛋白甲基转移酶NSD3及CARM1的抗肿瘤药物开发与应用

围绕NSD3开展药物研发。NSD3是组蛋白赖氨酸甲基转移酶NSD家族中的一员,能够催化H3K36me3的发生。虽然在多种肿瘤中都存在NSD3异常扩增,但其靶向药物的开发仍处于起步阶段,现有的NSD3化学探针BI-9231,通过与NSD3的脯氨酸-色氨酸-色氨酸-脯氨酸-1结构域特异性结合,阻断其生物学功能,但是仅能抑制MOLM-13等部分血液瘤细胞的增殖,对其他肿瘤无效。

研究发现在NSD3异常扩增的肺癌中,敲降NSD3可以抑制NCI-H1703和H520等肺癌细胞增殖。因此,以探针BI-9231为母核合成一系列NSD3降解剂。通过从增殖抑制和NSD3降解效率两方面对候选化合物进行筛选,得到活性化合物8。进一步研究发现化合物8能以时间、剂量依赖的方式通过蛋白酶体特异性降解NSD3,而对NSD家族其他蛋白不产生影响。在对降解剂发挥效应方式的探索中,发现化合物8能下调细胞周期相关的CDC25A以及抗凋亡蛋白MCL-1、Bcl-XL的表达,诱导细胞周期阻滞和凋亡的发生。

建立A549肺癌细胞的裸鼠皮下移植瘤模型,腹腔注射化合物8(100 mg/kg)36 h后,检测瘤组织中NSD3表达量,发现化合物8在体内也能发挥降解效应。总之,本部分研究开发出了在细胞和动物水平均能有效降解靶蛋白的特异性NSD3降解剂,对其进一步优化有可能成为肺癌临床治疗的新药。第二部分围绕CARM1展开药物开发。

CARM1属于I型组蛋白精氨酸甲基转移酶(protein arginine methyltransferases,PRMTs),能催化组蛋白H3的17或26位精氨酸发生不对称二甲基化。CARM1在肾癌中的表达显著高于癌旁正常组织,而且高表达CARM1的肾癌患者预后更差。

研究对由乙二胺类CARM1抑制剂改造的化合物进行筛选,得到与CARM1现有抑制剂相比,对肾癌有更好增殖抑制活性的化合物C-31,其能有效抑制CARM1甲基转移酶活性,以及A498肾癌皮下移植瘤的生长。

同时本研究发现p38-MAPK通路的激活是部分肾癌细胞对CARM1抑制剂耐药的原因,将CARM1抑制剂与p38通路的泛抑制剂SB203580联用,可以抑制细胞自噬、诱导凋亡,使耐药细胞对CARM1抑制剂增敏。

因此,研究获得了对肾癌在体内体外均有很好增殖抑制活性的化合物C-31,并为耐药肾癌细胞制定了可行的联合用药策略,扩大CARM1抑制剂潜在临床应用范围。

参考文献

[1]p38 Mediates Resistance to FGFR Inhibition in Non-Small Cell Lung Cancer.Zarczynska Izabela;GorskaArcisz Monika;Cortez Alexander Jorge;Kujawa Katarzyna Aleksandra;Wilk Agata Małgorzata;Skladanowski Andrzej Cezary;Stanczak Aleksandra;Skupinska Monika;Wieczorek Maciej;Lisowska Katarzyna Marta;Sadej Rafal;Kitowska Kamila.Cells,2021

[2]A NSD3-targeted PROTAC suppresses NSD3 and cMyc oncogenic nodes in cancer cells..Xu Chenxi;Meng Fanye;Park KwangSu;Storey Aaron J;Gong Weida;Tsai YiHsuan;Gibson Elisa;Byrum Stephanie D;Li Dongxu;Edmondson Rick D;Mackintosh Samuel G;Vedadi Masoud;Cai Ling;Tackett Alan J;Kaniskan HÜmit;Jin Jian;Wang Gang Greg.Cell chemical biology,2021

[3]Axitinib plus pembrolizumab in patients with advanced renal-cell carcinoma:Long-term efficacy and safety from a phase Ib trial.Atkins Michael B.;Plimack Elizabeth R.;Puzanov Igor;Fishman Mayer N.;McDermott David F.;Cho Daniel C.;Vaishampayan Ulka;George Saby;Tarazi Jamal C.;Duggan William;Perini Rodolfo;Thakur Mahgull;Fernandez Kathrine C.;Choueiri Toni K..European Journal of Cancer,2021

[4]Pontin arginine methylation by CARM1 is crucial for epigenetic regulation of autophagy.Yu Young Suk;Shin Hijai R.;Kim Dongha;Baek Seon Ah;Choi Seon Ah;Ahn Hyejin;Shamim Amen;Kim Jeonghwan;Kim Ik Soo;Kim Kyeong Kyu;Won Kyoung Jae;Baek Sung Hee.Nature Communications,2020

[5]张影.组蛋白甲基转移酶NSD3及CARM1的抗肿瘤药物开发与应用[D].中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所),2023.