NCI-H226人肺鳞癌贴壁细胞系的应用

背景^[1-3]

NCI-H226人肺鳞癌贴壁细胞系来源于男性肺鳞癌（胸膜间皮瘤）患者胸腔积液转移病灶。NCI-H226细胞可以用于3D细胞培养、癌症研究、高通量筛选、毒理学研究。

NCI-H226人肺鳞癌贴壁细胞系

NCI-H226人肺鳞癌贴壁细胞系细胞复苏、传代及冻存流程参考：

1、NCI-H226人肺鳞癌贴壁细胞系细胞复苏

1）配制完全培养基：基础培养基+胎牛血清+双抗（特殊培养基特殊配置）；

2）细胞复苏：取5ml完全培养基于15ml离心管中，37℃水浴锅预热，从液氮管（或者-80度冰箱）中快速取出冻存的细胞，放入37℃水浴锅中，摇晃使快速化冻（1min左右），然后将化冻的细胞和预热的培养基，移入超净工作台中，化冻的细胞加入到含预热培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5min；

3）吸弃上清，得到细胞沉淀，用2ml完全培养基轻轻重悬细胞，加入到T25培养瓶中，做好标记，放入37℃，5%CO2饱和适度培养箱中培养（培养皿复苏效果更好）；

4）24h后，观察细胞贴壁情况（未贴壁的即为死细胞--针对贴壁细胞），吸弃旧培养基，加入新鲜的预热（室温或37℃）的完全培养基，继续培养。

2、NCI-H226人肺鳞癌贴壁细胞系细胞传代

1）待细胞生长到80%-90%汇合度时，吸弃旧的培养基，加入1ml无菌PBS润洗一次，以去除残余的培养基及血清（血清含有胰酶的抑制因子），然后加入1ml 0.25%胰酶，37℃培养箱中消化（1~2min左右，不同细胞消化时间不同），取出细胞，镜下观察细胞至细胞皱缩变圆；

2）加入1ml完全培养基（含FBS）终止消化，轻轻拍打，使细胞脱落下来成单个细胞悬液，收集细胞于15ml无菌离心管中，1000rpm，离心5min；

3）收集细胞沉淀，完全培养基重悬，一分为二（可根据细胞生长速度调整比例），分别加入到2个新的培养瓶中，做好标记，放入培养箱中培养。

3、NCI-H226人肺鳞癌贴壁细胞系细胞冻存

1）按照细胞传代方法，在超净工作台内消化收集细胞沉淀，取少量细胞用于计数；

2）用预冷的1ml冻存液（90%完全培养基+10%DMSO）或者无血清细胞冻存液重悬细胞，加入到1.2ml冻存管中，密度为1*106个/ml。

3）放入程序冻存盒，-80℃过夜后，转入液氮长期保存。

应用^[4][5]

NCI-H226人肺鳞癌贴壁细胞系可以用于组蛋白乳酸化调控TRIM29影响肺鳞癌进展的机制研究

利用生物信息学、细胞生物学和分子生物学等技术,探讨组蛋白乳酸化通过TRIM29调控肺鳞癌细胞生物学行为的机制。本研究为肺鳞癌分子靶向治疗提供新的潜在靶点。

方法:1、生物信息学、临床肺鳞癌石蜡包埋组织切片分析TRIM29在癌与癌旁正常组织中的表达,分析TRIM29与肺鳞癌患者的临床特征及预后相关性。

2、RT-qRCR、Western blot及细胞免疫荧光验证肺鳞癌细胞株中TRIM29的表达及靶向TRIM29的siRNA转染效果。CCK8增殖实验、细胞划痕等实验证实TRIM29表达量变化对肺鳞癌细胞生物学行为的影响。

3、生物信息学分析LDHA在肺鳞癌的癌与癌旁正常组织中的表达;免疫组化分析肺鳞癌石蜡包埋组织中组蛋白乳酸化Pan Kla、H3K181a的细胞表达定位;RT-qPCR、Western blot及细胞免疫荧光验证Pan Kla、H3K181a在肺鳞癌细胞株中的表达。

4、CCK8增殖实验、细胞划痕、小室迁移及侵袭实验、克隆形成实验等分析糖酵解抑制剂对肺鳞癌细胞生物学行为的影响;Western blot、RT-qPCR验证糖酵解抑制剂干预后肺鳞癌细胞系中组蛋白乳酸化Pan Kla、H3K181a水平以及TRIM29表达的变化。

结果:1、通过下载及分析TCGA数据库中肺鳞癌基因表达和临床病理信息,结果显示,与相对应的肺正常组织比较,TRIM29在肺鳞癌中高表达(P<0.05);TRIM29的表达与临床特征以及患者的生存时间无相关性;免疫组化结果显示,TRIM29定位在细胞质。

2、与正常肺支气管上皮细胞BEAS-2B相比,肺鳞癌细胞株NCI-H520及NCI-H226中的TRIM29表达量均更高;TRIM29 siRNA可以有效下调TRIM29蛋白的表达水平;下调TRIM29表达后肺鳞癌细胞增殖、迁移能力下降。

3、通过下载及分析TCGA数据库中肺鳞癌基因表达和临床病理信息,结果显示,与相对应的肺正常组织比较,LDHA在肺鳞癌中高表达;免疫组化显示Pan Kla和H3K181a均定位在细胞核;与正常肺支气管上皮细胞BEAS-2B相比,肺鳞癌细胞株NCI-H520及NCI-H226中的组蛋白乳酸化Pan Kla和H3K181a水平升高。

4、CCK8增殖实验、细胞划痕、小室迁移及侵袭实验、克隆形成实验等结果表明,糖酵解抑制剂可有效抑制肺鳞癌细胞增殖、迁移与克隆形成能力;且糖酵解抑制剂同时降低组蛋白乳酸化水平、TRIM29的mRNA及蛋白表达水平。

结论:1、TRIM29是肺鳞癌中重要的促癌基因,可作为诊断肺鳞癌疾病的重要生物标志物。

2、组蛋白乳酸化水平降低可抑制肺鳞癌的进展。

3、组蛋白乳酸化调控TRIM29的表达影响肺鳞癌进展。

参考文献

[1]Lactate,histone lactylation and cancer hallmarks..Dai Xiaofeng;Lv Xinyu.Expert reviews in molecular medicine,2023

[2]Lactylome analysis suggests lactylation-dependent mechanisms of metabolic adaptation in hepatocellular carcinoma..Yang Zijian;Yan Cong;Ma Jiaqiang;Peng Panpan;Ren Xuelian;Cai Shangli;Shen Xia;Wu Yingcheng;Zhang Shu;Wang Xiaoying;Qiu Shuangjian;Zhou Jian;Fan Jia;Huang He;Gao Qiang.Nature metabolism,2023

[3]Targeting lactate dehydrogenase B-dependent mitochondrial metabolism affects tumor initiating cells and inhibits tumorigenesis of non-small cell lung cancer by inducing mtDNA damage.Deng Haibin;Gao Yanyun;Trappetti Verdiana;Hertig Damian;Karatkevich Darya;Losmanova Tereza;Urzi Christian;Ge Huixiang;Geest Gerrit Adriaan;Bruggmann Remy;Djonov Valentin;Nuoffer Jean Marc;Vermathen Peter;Zamboni Nicola;Riether Carsten;Ochsenbein Adrian;Peng Ren Wang;Kocher Gregor Jan;Schmid Ralph Alexander;Dorn Patrick;Marti Thomas Michael.Cellular and Molecular Life Sciences,2022

[4]Identification of lysine-lactylated substrates in gastric cancer cells.Yang Dawei;Yin Jie;Shan Liuqun;Yi Xingling;Zhang Wei;Ding Yongbin.iScience,2022

[5]赖建飞.组蛋白乳酸化调控TRIM29影响肺鳞癌进展的机制研究[D].南昌大学,2023.