NCI-H661人大细胞肺癌贴壁细胞系的应用

背景^[1-3]

NCI-H661人大细胞肺癌贴壁细胞系源自一位43岁患有大细胞肺癌白人男性的淋巴结转移病灶。NCI-H661细胞没有产生粘液和鳞状分化的亚显微结构和生化证据。NCI-H661细胞表达的p53 mRNA较高，明显高于正常肺细胞的水平，与此同时没有出现明显的DNA结构异常，说明存在点突变或很小的变异。NCI-H661细胞角蛋白和波形蛋白纤维染色阳性，神经丝三联体蛋白阴性。NCI-H661人大细胞肺癌贴壁细胞系是其中一种常见的细胞系，被广泛应用于肿瘤研究和药物筛选等领域。

NCI-H661人大细胞肺癌贴壁细胞系

NCI-H661人大细胞肺癌贴壁细胞系细胞复苏、传代及冻存流程参考：

1、NCI-H661人大细胞肺癌贴壁细胞系细胞复苏

1）配制完全培养基：基础培养基+胎牛血清+双抗（特殊培养基特殊配置）；

2）细胞复苏：取5ml完全培养基于15ml离心管中，37℃水浴锅预热，从液氮管（或者-80度冰箱）中快速取出冻存的细胞，放入37℃水浴锅中，摇晃使快速化冻（1min左右），然后将化冻的细胞和预热的培养基，移入超净工作台中，化冻的细胞加入到含预热培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5min；

3）吸弃上清，得到细胞沉淀，用2ml完全培养基轻轻重悬细胞，加入到T25培养瓶中，做好标记，放入37℃，5%CO2饱和适度培养箱中培养（培养皿复苏效果更好）；

4）24h后，观察细胞贴壁情况（未贴壁的即为死细胞--针对贴壁细胞），吸弃旧培养基，加入新鲜的预热（室温或37℃）的完全培养基，继续培养。

2、NCI-H661人大细胞肺癌贴壁细胞系细胞传代

1）待细胞生长到80%-90%汇合度时，吸弃旧的培养基，加入1ml无菌PBS润洗一次，以去除残余的培养基及血清（血清含有胰酶的抑制因子），然后加入1ml 0.25%胰酶，37℃培养箱中消化（1~2min左右，不同细胞消化时间不同），取出细胞，镜下观察细胞至细胞皱缩变圆；

2）加入1ml完全培养基（含FBS）终止消化，轻轻拍打，使细胞脱落下来成单个细胞悬液，收集细胞于15ml无菌离心管中，1000rpm，离心5min；

3）收集细胞沉淀，完全培养基重悬，一分为二（可根据细胞生长速度调整比例），分别加入到2个新的培养瓶中，做好标记，放入培养箱中培养。

3、NCI-H661人大细胞肺癌贴壁细胞系细胞冻存

1）按照细胞传代方法，在超净工作台内消化收集细胞沉淀，取少量细胞用于计数；

2）用预冷的1ml冻存液（90%完全培养基+10%DMSO）或者无血清细胞冻存液重悬细胞，加入到1.2ml冻存管中，密度为1*106个/ml。

3）放入程序冻存盒，-80℃过夜后，转入液氮长期保存。

应用^[4-5]

NCI-H661人大细胞肺癌贴壁细胞系可以用于南美响尾蛇神经毒素(Crotoxin)诱导NCI-H661细胞凋亡机制研究

观察南美响尾蛇神经毒素(crotoxin,Cr TX)对人大细胞肺癌细胞体外培养抗肿瘤作用,以及对人大细胞肺癌细胞裸鼠移植瘤抗肿瘤作用,并探讨其相关作用机制。

方法:通过四唑盐还原法(CCK-8)检测南美响尾蛇神经毒素(crotoxin)、吉非替尼(Gefinitib)及两药联合应用对人大细胞肺癌NCI-H661细胞的生长抑制率,应用细胞集落平板克隆实验观察crotoxin、gefinitib及两药联合应用对NCI-H661细胞的集落形成的影响;应用流式细胞术检测crotoxin、gefinitib及两药联合应用对NCI-H661细胞周期及细胞凋亡率的影响,并检测以SB203580抑制p38活性,以PFT-α抑制wtp53的活性后NCI-H661细胞周期及细胞凋亡率的变化;应用蛋白免疫印迹法(Western blot)测定crotoxin、gefinitib及两药联用对NCI-H661细胞内p38MAPK、wtp53、phospho-p38MAPK、bax、bcl-2及caspase-3活性亚单位p17蛋白表达水平影响,并测定以SB203580抑制p38活性,以PFT-α抑制wtp53的活性后crotoxin、gefinitib及两药联合应用对NCI-H661细胞内以上6种蛋白表达水平变化。

将人大细胞肺癌NCI-H661细胞接种裸鼠腋下建立荷瘤裸鼠模型。将荷瘤裸鼠随机分为6组,crotoxin组、gefinitib组、crotoxin+gefiniti组、crotoxin+SB203580组、crotoxin+PFT-α组和阴性对照组。实验组裸鼠腹腔注射给药,每三天给药一次,同时阴性对照组注射等量生理盐水。给药4周后完整取出皮下移植瘤结节,对比较不同干预组和对照组移植瘤瘤重,计算抑瘤率。结果:Crotoxin对NCI-H661细胞有生长抑制作用,与gefinitib联用可增强gefinitib抗肿瘤效果,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);Crotoxin对NCI-H661细胞集落形成有抑制作用,与gefinitib联用可增强gefinitib对NCI-H661细胞集落形成抑制效果,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);Crotoxin对人大细胞肺癌NCI-H661细胞有诱导凋亡和细胞周期G1期阻滞作用,且crotoxin与gefinitib联用可增强gefinitib对NCI-H661细胞诱导凋亡和细胞周期G1期阻滞作用,以SB203580抑制p38活性,以PFT-α抑制wtp53的活性后,crotoxin诱导凋亡和细胞周期G1期阻滞作用可被抑制。

Western blot实验中crotoxin、gefinitib、crotoxin+gefinitib组中phospho-P38MAPK、wt P53、caspase3活性亚单位P17、bax蛋白表达水平与对照组相比表达增高,且crotoxin、gefinitib组表达量接近,Crotoxin+Gefinitib组高于前两者;bcl-2蛋白表达水平较对照组下调,且crotoxin+gefinitib组低于crotoxin、gefinitib组,差异有统计学意义。crotoxin+SB203580组中phospho-P38MAPK、wt P53、caspase3活性亚单位P17、bax、bcl-2蛋白表达水平与对照组相接近,差异无统计学意义。

Crotoxin+PFT-α组中phospho-P38MAPK、wt P53蛋白表达水平比对照组高,差异有统计学意义;caspase3活性亚单位P17、bax、bcl-2蛋白表达水平与对照组无明显变化,差异无统计学意义。各组中p38MAPK蛋白表达水平接近对照组,无统计学差异。Crotoxin,gefinitib均对人大细胞肺癌NCI-H661细胞移植瘤生长有抑制作用,二者联合应用可显著提高抑瘤作用,其抑瘤率分别是39.5%、43.7%及75.1%,与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

参考文献

[1]The Drosophila DUSP Puckered is phosphorylated by JNK and p38 in response to arsenite-induced oxidative stress.Katerina Karkali;;George Panayotou.Biochemical and Biophysical Research Communications,2012

[2]Critical role of hydrogen peroxide signaling in the sequential activation of p38 MAPK and eNOS in laminar shear stress..Free Radical Biology and Medicine,2012

[3]Helicobacter pylori CagA inhibits the expression of Runx3 via Src/MEK/ERK and p38 MAPK pathways in gastric epithelial cell.ZhifangLiu;XiaXu;LongChen;WenjuanLi;YundongSun;JipingZeng;HanYu;ChunyanChen;JihuiJia.J.Cell.Biochem.,2012

[4]Angiotensin-(1–7)Inhibits Vascular Remodelling in Rat Jugular Vein Grafts via Reduced ERK1/2 and p38 MAPK Activity.J-G Wu;;H Tang;;Z-J Liu;;Z-F Ma;;A-L Tang;;X-J Zhang;;X-R Gao;;H Ma.Journal of International Medical Research,2011

[5]李睿.南美响尾蛇神经毒素(Crotoxin)诱导NCI-H661细胞凋亡机制研究[D].苏州大学,2015.