蛋白质电泳染色剂的应用

背景^[1-3]

蛋白质电泳染色剂是一种高度灵敏的即用型荧光染色剂，用于检测通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离的总蛋白。它非常适合在1D和2D PAGE中使用。SYPRO Ruby凝胶染色剂的灵敏度可媲美或超过一流银染技术。染色蛋白可使用含有适当过滤器或激光的标准紫外线或蓝光透射仪或者成像设备进行观察。

蛋白质电泳染色剂

考马斯染料染色

考马斯染料（也称为考马斯蓝或考马斯亮蓝）是用于蛋白质（通过蛋白质凝胶电泳分离）可视化的常用染料。基于考马斯的染色剂易于染色，并具有良好的定量线性和灵敏度。基于考马斯的染料不会永久性地化学修饰靶蛋白，而是通过非共价力来相互作用。由于没有发生化学修饰，因此可以完全去除染色的蛋白条带，并将回收的蛋白用于质谱或测序分析。

在酸性条件下，考马斯染料与蛋白质的碱性和疏水残基结合，颜色从暗红色变为深蓝色。与所有染色方法一样，考马斯染料试剂基于其化学作用和蛋白质组分差异，检测某些蛋白质的效果要优于其他方法。因此，考马斯染料可检测到某些低至8-10 ng的蛋白条带，对于大多数蛋白检测需要每条带25 ng。

存在两种形式的染料——R-250（R代表淡红色）和G-250（G代表淡绿色）。两种变体均提供相同的相对灵敏度并易于检测。考马斯G-250（也称为胶体考马斯染料）提供了更快的染色方案，并消除了脱色的需要。

银染试剂

银染是检测总蛋白最灵敏的比色方法。该技术需要在蛋白条带的位置将金属银沉积到凝胶表面上。银离子（来自染色剂中的硝酸银）与某些蛋白质官能团相互作用并结合。银离子与羧酸基团（天冬氨酸和谷氨酸）、咪唑（组氨酸）、巯基（半胱氨酸）和胺基（赖氨酸）相互作用最强。各种敏化剂和增强剂对于控制银离子与蛋白质结合的特异性和效率，以及结合的银向金属银的有效转化（显影）至关重要。显影过程与胶卷基本相同：银离子被还原为金属银，形成棕黑色。

银染方案需要几个步骤，受试剂质量、孵育时间和凝胶厚度的影响。商业银染试剂盒的一个优点是，配方和操作规程得到了优化和一致的制造，有助于程度地提高实验结果的一致性。具有优化方案的试剂盒功能强大且易于使用，可检测典型凝胶中不到0.5 ng的蛋白质。

银染剂使用戊二醛或甲醛作为增强剂。这些试剂可引起凝胶基质中蛋白质的化学交联，从而限制了与用于质谱分析（MS）的脱色和洗脱方法的相容性。因此，当采用银染作为MS工作流程的一部分时，灵敏度与蛋白质可回收性的优化至关重要。

可以制备银染制剂，以使蛋白条带染黑、蓝褐色、红色或黄色，这取决于它们的电荷和其他特征。这对于区分2D凝胶上的重叠斑点特别有用。

荧光染料染色

荧光染色剂具有高灵敏度，并且结合了简单的染色方案。大多数荧光染色剂提供的灵敏度与使用银染色技术获得的灵敏度相似，可以用作1D或2D电泳中银染色的良好替代方法。与银染剂不同，荧光染剂需要可视化设备。可以使用标准的紫外线或蓝/绿光透射照明器或配备有适当滤镜的成像仪查看典型的染色结果。荧光蛋白凝胶染料提供线性定量范围，有些染料报告超过三个数量级。

应用^[4][5]

蛋白质电泳染色剂可以用于肝癌发生发展血清蛋白质组的比较研究和结合珠蛋白动态变化及N－聚糖特征的探索

尝试蛋白质组学中双向电泳-质谱技术(2-DE-MS)分别筛选肝癌发生发展各个阶段过程中血清中肿瘤标记蛋白,对筛选出的潜在肝癌血清标记物进行下一步的验证。同时应用MP技术双向电泳(2-DE)并进行复合染色,然后应用免疫沉淀和多种凝集素印迹。运用前一种方法,获得了肝癌、肝硬化、慢性肝炎和正常健康者血清糖蛋白质修饰谱;运用后一种方法对上述肝癌发生发展过程中的各个疾病阶段进行研究,发现HP-β链异常核心岩藻糖基化状态及差异性表达,分析HP-β链的糖链结构的改变与肝癌发生发展过程中的关系。

总之,HP-β链的蛋白表达水平和N-糖链结构的改变与肝癌发生发展过程中的关系。

人血清蛋白质组研究方法的比较和优化目的:优化血清蛋白质组双向电泳(2-DE)技术,建立适合本实验的技术方法。

方法:用健康人血清样本,通过改进样品制备,包括高丰度蛋白的去除,对传统的双向凝胶电泳技术的程序及有关环节进行改进,如等电聚焦程序、溶胀液成分和凝胶染色方法(考马斯亮蓝R-250染色和SYPRO-Ruby荧光染色)进行了一系列的比较和优化,提高2-DE对血清蛋白的分辨能力。

结果:获得了较为理想的电泳图谱:考马斯亮蓝染色和SYPRO-Ruby荧光染色相比,血清2-DE图谱共检测到平均蛋白质点数分别是324±25(n=3)和785±30(n=3);去除高丰度蛋白前后,未做处理的血清、去除蛋白和IgG血清的2-DE图谱共检测到平均蛋白点数分别是501±25(n=3)和813±22(n=3);图谱分辨率得到明显的提高,水平条带及纵向拖尾现象明显减少。

同时,2-DE的重复性也有大幅度提高:同组样品在三次不同实验中所得蛋白质斑点数目分别为782、728和800个。去除高丰度蛋白并结合SYPRO-Ruby荧光染色可以大大提高血清低丰度的解析能力。

结论:建立并优化了血清蛋白质2-DE技术,为进一步开展疾病血清蛋白组学研究奠定基础。

参考文献

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[5]舒宏.肝癌发生发展血清蛋白质组的比较研究和结合珠蛋白动态变化及N－聚糖特征的探索[D].广西医科大学,2008.