重组抑肽酶的合成

介绍

重组抑肽酶(RTI16)可以抑制激肽酶和胰蛋白酶，是天然的非特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂[1]。它是由58个氨基酸残基组成的单链碱性蛋白，链中有3个二硫键相互交联。长期以来抑肽酶用于急性胰腺炎的治疗，90年代后，重组抑肽酶开始用于心肺胸外科手术[2]，用以保护血小板，减少出血和渗血，以及对有凝血障碍病人的临床治疗。因而抑肽酶的市场规模迅速扩大，一跃成为重要的生化药物之一。

图一 重组抑肽酶

合成

目前市售的重组抑肽酶制剂主要为牛肺等器官的提取物，工艺复杂、成本高，因而探讨用基因工程方法生产重组抑肽酶有重要意义。

采用分泌表达体系时，抑肽酶产量普遍偏低，所得产品的活性也较低[3，4]。通过融合表达，有望大大提高重组抑肽酶表达量。为此构建了重组抑肽酶表达质粒pGrxA-BPTI，并在融合伙伴和重组抑肽酶之间设计了FXa的识别位点。以包涵体形式表达后通过凝胶过滤纯化和复性[5，6]，通过FXa将融合伙伴切除，可得到与天然产物活性相当的蛋白，通过表达条件的优化，产量较以往的表达系统有明显提高。

工程菌表达优化：接种甘油管菌种于LB/Amp平板上，37 ℃培养20 h，刮取菌落接种至LB/Amp液体培养基5 mL，37 ℃，200 r/min，培养过夜。以5%接种量接入玉米浆培养基100 mL，37 ℃，220 r/min摇床培养，诱导7 h后离心(8 000 r/min，5 min，4 ℃)收集菌体，称量菌体湿重，15%SDS-PAGE检测表达情况。

发酵罐培养：采用德国Biostat 30 L发酵罐，37 ℃，控制溶氧20%，pH 7.0。用发酵罐表达融合蛋白,16 L发酵液共得湿菌体260 g,约16 g/L;表达量约45%,

菌体的破壁及包涵体的获取：培养结束后收集菌体，1 g菌体加入溶液A(50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，1 mmol/L EDTA)10 mL，充分悬浮后，冰浴超声破碎细胞，工作30 s，间隔10 s，功率400 W，30个循环。液体转入离心管，4 ℃，8 000 r/min离心15 min，沉淀即为包涵体粗品。

包涵体溶解液的制备：将包涵体粗品用溶液B(50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，1 mmol/L EDTA，1%Triton-X100)洗涤两次，每次作用0.5 h，离心去上清，得到比较纯净的包涵体。1 g包涵体加入溶液C(50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，8 mol/L尿素，1 mmol/L EDTA，5 mmol/L DTT)5 mL，4 ℃下过夜，变性溶解，经12 000 r/min离心15 min，收集上清即为包涵体溶解液。得到重组抑肽酶。

参考文献

[1] Ascenzi P,Bocedi A,Bolognesi M,et al.The bovine basic pancreatictrypsin inhibitor(Kunitz inhibitor):a milestone protein[J].CurrProtein Pept Sci,2003,4(3):231-251.

[2] Sylvie R,Bertil K.Aprotinin[J].Ann Pharmacother,1996,30(4):372-376.

[3] Conni L,Poul E.BPTI and-Nterminal extended analogues generatedby factor Xa cleavage and cathepsin C trimming of a fusion protein inexpressed inE.coli[J].Protein Expr Purif,1991,2(5-6):372-378.

[4] Bjorn N,Cara B.Secretion incompetence of bovine pancreatic trypsininhabitor expression inE.coli[J].J Biol Chem,1995,266(5):2 970.

[5] Gu ZY,Marianne Weidenhaupt.Chromatographic methods for theisolation and refolding of proteins fromE.coliinclusion bodies[J].Protein Expr Purif,2002,25(1):174-179.

[6] 姚佳(Yao J),杨坤(Yang K),杨建波(Yang JB),等.新型重组纤维蛋白原受体拮抗剂的表达、纯化及活性研究[J].中国药科大学学报(J China Pharm Univ),2005,36(2):173-178.