蟾毒它灵的药理作用及制备

背景及概述^[1]

《中华人民共和国药典》中明确记载了蟾酥为蟾蜍科动物中华大蟾蜍( Bufo bufo gargarizansCantor) 或黑眶蟾蜍( Bufo melanostictus Schneider) 的耳后腺及皮肤腺分泌的白色浆液经加工干燥而成。蟾酥性温，味甘、辛，有毒，具有解毒、止痛、抗肿瘤等多种功效。临床用于恶性肿瘤、止痛、麻醉、抗感染、白细胞减少症、周围性面神经麻痹等，对肝癌、肠癌、白血病、皮肤癌等多种癌症具有较好的疗效。

蟾毒它灵是蟾酥中的主要化合物之一。众多的研究发现蟾毒它灵具有良好的抗肿瘤活性，具有很大的药物应用开发前景。目前含有蟾毒它灵的口服液、片剂已应用于临床，对肝癌、肺癌、胃癌等具有较好的疗效。蟾毒它灵毒性较大，口服后会产生全身性的毒副作用，而且由于肝脏的首过效应，不利于药物蓄积于肿瘤部位，因此起效慢，制剂的生物利用度较低。

结构

药理作用 ^[2]

蟾毒它灵具有很好的肿瘤细胞生长抑制活性，而且抗瘤谱广泛。从蟾酥中分离得到蟾毒它灵等化合物，并利用MTT 法测试了蟾毒它灵等化合物对人肿瘤Hela 细胞的细胞毒活性，测得蟾毒它灵的半数抑制浓度IC50为0.11 μM。以原代肝癌细胞系PLC /PRF /5 ( PLC) 开展了蟾毒甾烯类化合物的活性与结构之间关系的研究，其中蟾毒它灵对PLC /PRF /5 ( PLC) 细胞的IC50为3.4 × 10-4μg /mL Nogawa，对人鼻咽癌Kb 细胞的IC50为0.19 μg /mL，对人类粒细胞白血病HL60 细胞的IC50 ＜ 0.01 μg /mL，对鼠白血病MH60 细胞的IC50 ＞ 25 μg /mL。开展蟾毒它灵对肿瘤细胞生长抑制研究，结果发现蟾毒它灵对人肝癌Hep 3B 细胞、人大肠癌HT-29 细胞和人乳腺癌MCF7 细胞给药6 天的IC50分别为0.24 ± 0.02 μM，0 .23 ± 0.03 μM 和0.15 ±0.02 μM。基于蟾毒它灵良好的肿瘤细胞抑制活性，其作用机理引起广泛关注，蟾毒它灵等蟾毒甾烯是与洋地黄相似的强心苷类化合物，能够分化白血病细胞和黑色素瘤细胞。同。

考察蟾毒它灵对人胃癌BGC-823 细胞的细胞毒作用，发现蟾毒它灵能剂量依赖地抑制BGC-823 细胞的存活，在1 μM 时抑制率达到61%。通过对作用机理的研究发现，蟾毒它灵能呈剂量依赖性地使细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染。蟾毒它灵呈剂量依赖性地促进了细胞的磷脂酰丝氨酸的外翻，表明蟾毒它灵诱导了细胞凋亡。在1 μM 浓度时，其促凋亡能力与10 μM 喜树碱( CPT) 相当。活化的caspase-3 仅在凋亡细胞中发现，在检测活化的caspase-3 时发现蟾毒它灵能促进caspase-3 活性形式的增加。这表明蟾毒它灵促进BGC-823 细胞的凋亡可能通过caspase-3 通路。

蟾毒它灵对肿瘤细胞生长抑制的作用机理研究结果发现，1.13 μM 的蟾毒它灵能够随时间的增加显著提高人肝癌Hep 3B 细胞sub-G1 期细胞的量，在24 h 时为10.0%，而72 h 时达到57.2%。当0.45 μM 的蟾毒它灵给药超过48h 时能够检测到DNA 碎片。利用Hoechst33258 染色后可以检测到凋亡小体。信号通路可能经由激活caspase-8，增加线粒体内的tBid，降低线粒体膜电位，并且异位凋亡诱导因子( AIF ) 。活化的caspase-8 可能激活caspase-9 和caspase-3，导致核内PARP 分裂。AIF 的存在和核内分裂的PARP 可能导致DNA 断裂。Caspase-8 抑制剂( Z-IETD) 或广谱caspase 抑制剂( Z-VAD) 可以显著抑制蟾毒它灵诱导的凋亡，而anti-Fas 中和抗体却无效，这显示蟾毒它灵诱导Hep 3B 细胞凋亡可能包括caspases 和AIF。

制备^[2]

在早期，通过传统的柱分离方式或薄层色谱( TLC) 方式很难将蟾蜍甾烯进行分离。利用填充了Li-Chromprep Si-60 的Lobar B 柱可将这些蟾蜍毒素成功分离。此后以疏水凝胶Sephadex LH-20 及HP-cellulofine 为载体利用新的色谱方法分离得到了蟾毒它灵，并考察了Sephadex LH-20 及HPcellulofine柱层析对包括蟾毒它灵在内的10 种蟾蜍甾烯的分离效果。结果发现，利用n-hexane /CH2Cl2 /MeOH ( 4∶ 5∶ 1) ，n-hexane /CHCl3 /MeOH ( 4∶ 5∶ 1) 和n-hexane /toluene /MeOH ( 3∶ 2∶ 1) 作为洗脱剂可以使蟾蜍甾烯得到很好分离。确定了流速、载体粒径和柱长与分离效果的关系，此外还比较了Sephadex LH-20、HP-cellulofine 的分离状况及与硅胶薄层色谱的关系。

在国内，取蟾酥以甲醇回流提取，减压浓缩，得甲醇干浸膏，环己烷萃取后的剩余浸膏以水混悬后氯仿萃取，得氯仿萃取物，硅胶拌样，干法行硅胶柱色谱。用氯仿、氯仿-甲醇梯度洗脱，相关流份再干法拌样行硅胶小柱色谱，其中的一个流份经乙酸乙酯重结晶，得蟾毒它灵。将中华大蟾蜍皮经95%乙醇冷浸，浸膏的石油醚萃取部位经硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱，所得到的流份再通过反复硅胶柱、ODS 反相柱、制备液相等手段分离，得到了包括蟾毒它灵在内的6 个化合物。随着研究的深入，一些蟾毒它灵的衍生物也陆续被发现。从蟾蜍皮中分离得到一个新的蟾蜍毒素，为蟾毒它灵3-丁二酰精氨酸酯。

主要参考资料

[1] CN201110147785.1 一种蟾毒它灵干粉吸入剂及其制备方法、应用

[2] 蟾毒它灵的研究进展

[3] 蟾毒它灵体内外抗肿瘤作用的研究