人淋巴瘤细胞的应用

背景^[1-3]

人淋巴瘤细胞来源于一43岁男性的腹水，为B淋巴细胞。EB病毒阴性，具有t(14；18)易位。

人淋巴瘤细胞

人淋巴瘤细胞培养操作:

1)复苏人淋巴瘤细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后轻轻吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6 cm皿中，加入约4 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)人淋巴瘤细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

方法一：收集细胞，1000RPM条件下离心3-5min分钟，弃去上清液，补加1-2ml培养液后吹匀，将细胞悬液按1:2到1:4的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

方法二：可选择半数换液方式，弃去半数培养基后，将剩余细胞悬起，将细胞悬液按1:2到1:3的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3)人淋巴瘤细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

人淋巴瘤细胞可以用于热疗提高人淋巴瘤细胞SU-DHL-6对NK细胞杀伤敏感性的实验研究

通过对热疗前后人淋巴瘤细胞SU-DHL-6生物学特性的研究,探讨热疗能否改变SU-DHL-6细胞对NK细胞的杀伤敏感性及其可能相关的分子机制是什么,从而为热疗用于淋巴瘤的综合治疗提供理论依据。

研究方法章人B细胞淋巴瘤细胞系SU-DHL-6细胞的生物学特性常规培养SU-DHL-6细胞,光镜下观察其细胞形态及生长特点；细胞计数法绘制生长曲线并计算倍增时间；流式细胞仪分析SU-DHL-6细胞的免疫表型及细胞周期分布；MTT法分析其耐药谱。

第二章热疗对SU-DHL-6细胞的体外抑制作用MTT法分析不同温度(40、42、43。)热疗对SU-DHL-6的生长抑制率；光镜下观察热疗后SU-DHL-6细胞的形态变化；流式细胞仪分析热疗后SU-DHL-6细胞的细胞周期分布及细胞凋亡情况；ELISA法分析热疗后SU-DHL-6细胞HSP70蛋白水平的表达情况；

第三章热疗前后SU-DHL-6细胞对NK细胞的体外杀伤敏感性取3例正常人外周血单个核细胞,免疫磁珠法分选得高纯度NK细胞作为效应细胞,以热疗前后SU-DHL-6细胞作为靶细胞,采用CFSE/PI双染法,用流式细胞仪检测效靶比为20：1时热疗前后SU-DHL-6细胞对NK细胞的体外杀伤敏感性。

第四章热疗提高SU-DHL-6细胞对NK细胞杀伤敏感性机制的初步探讨RT-PCR检测热疗前、42℃热疗60min后继续常规培养48h后SU-DHL-6细胞NKG2D配体基因及hsp70基因的表达情况。

结果1.人淋巴瘤SU-DHL-6细胞呈圆形,透光性好,体积大,单个或成团悬浮生长,细胞群体倍增时间为23.12h。SU-DHL-6细胞为B淋巴细胞,高表达B细胞表面标志；细胞周期为：Go/G1期细胞占33.8%,S期细胞占61.4%、G2/M期细胞占4.85%。不同化疗药物在不同作用浓度下对SU-DHL-6细胞的生长抑制作用有差异,均呈浓度依赖性。

2. 随着温度的升高,热疗对SU-DHL-6细胞的生长抑制作用逐渐增强；光镜下观察热疗后SU-DHL-6细胞包浆中颗粒增加,薄膜膜完整,但光滑性欠佳；热疗后细胞周期分布情况：Go/G1期细胞占25.1%,S期细胞占48.1%、G2/M期细胞占26.9%；热疗后细胞凋亡率为34.4%。热疗后HSP70表达量增加,随着培养时间的延长,又逐渐恢复正常,在热疗后48小时表达水平最高。

3. 效靶比为20：1时,热疗干预后的SU-DHL-6细胞对NK细胞的杀伤敏感性高于热疗前。

4. 热疗干预后,HSP70及NKG2D配体基因(ULBP2除外)的表达量上调。

结论1.热疗能够抑制SU-DHL-6细胞的生长,促进细胞凋亡,改变细胞周期分布,G0/G1期、S期细胞减少,相对增加G2/M期细胞的比例。

2.热疗可以提高SU-DHL-6细胞对NK细胞杀伤敏感性,其机制可能是①热疗提高了HSP70的表达量,参与调节NK细胞的活化。②热疗上调了SU-DHL-6细胞表面活化性受体NKG2D相应配体基因的表达有关。

参考文献

[1]Tumorigenic adenovirus 12 cells evade NK cell lysis by reducing the expression of NKG2D ligands.Christa Y.Heyward;;Rajen Patel;;Emily M.Mace;;Jennifer T.Grier;;Hancheng Guan;;Andrew P.Makrigiannis;;Jordan S.Orange;;Robert P.Ricciardi.Immunology Letters,2012

[2]Inhibition of checkpoint kinase 1 abrogates G2/M checkpoint activation and promotes apoptosis under heat stress..Furusawa Yukihiro;;Iizumi Takashi;;Fujiwara Yoshisada;;Zhao Qing-Li;;Tabuchi Yoshiaki;;Nomura Takaharu;;Kondo Takashi.Apoptosis:an international journal on programmed cell death,2012

[3]Heat Shock Proteins:A Potential Anticancer Target.Kamalesh K.Sankhala;Monica M.Mita;Alain C.Mita;Chris H.Takimoto.Current Drug Targets,2011

[4]Heat shock protein expression and temperature distribution in prostate tumours treated with laser irradiation and nanoshells.Marissa Nichole Rylander;;R.Jason Stafford;;John Hazle;;Jon Whitney;;Kenneth R.Diller.International Journal of Hyperthermia,2011

[5]李素毅.热疗提高人淋巴瘤细胞SU-DHL-6对NK细胞杀伤敏感性的实验研究[D].郑州大学,2012.