结肠癌细胞株的应用

背景^[1-3]

结肠癌细胞株该细胞由Klebe RJ和Ruddle FH建立，来源于Albino A系小鼠的自发神经母细胞瘤；可产生大量的微管蛋白，该蛋白在对神经细胞的轴浆流动起主要作用的收缩系统中发挥重要作用。该细胞可用于研究长春新碱沉淀微管蛋白的机制、GTP与分离蛋白结合的动力学、体内微管蛋白的流动和微管蛋白的合成与聚集。OIE组织用该细胞做狂犬病的常规诊断。

结肠癌细胞株

结肠癌细胞株细胞培养步骤:

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备RPMI-1640培养基，80%；优质胎牛血清，20%。

2）结肠癌细胞株培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）结肠癌细胞株冻存液：90%*培养基，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

二．结肠癌细胞株处理：

1）复苏结肠癌细胞株细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）结肠癌细胞株细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）结肠癌细胞株细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%DMSO后进行冻存。

应用^[4][5]

结肠癌细胞株可以用于PD-L1对抗肿瘤药物介导的结肠癌细胞凋亡的影响

BRAF突变的结直肠癌预后较差,并且对目前治疗不敏感。结直肠癌BRAF(V600E)突变往往与微卫星不稳定型(MSI)相关,免疫检查点抑制剂对该类型结直肠癌具有一定疗效。

最近的临床研究表明,抗PD-L1抗体仅对MSI突变型的结直肠癌有疗效。很少证据表明BRAF在肿瘤细胞中能起到免疫调节作用。DNA错配修复缺失的结直肠癌常发生BRAF突变,并对抗PD-1抗体有一定疗效。人们主要关注在肿瘤免疫治疗的肿瘤PD-L1与T细胞PD-1相互作用的机制问题上。最初的报道称肿瘤PD-L1可杀伤抗肿瘤的T细胞,而现在大部分关于PD-L1的研究主要集中于肿瘤细胞胞外的PD-L1与T细胞之间的相互作用。

然而,最近的研究表明黑色素瘤PD-L1可能通过细胞内部结构来调节其细胞凋亡,并能通过激活蛋白激酶信号来改变细胞有丝分裂。而对结直肠癌PD-L1来讲,是否也具有调节肿瘤内部信号通路的能力及其调控抗肿瘤药物耐药的机制值得深入探究。

方法1.TCGA数据库的基因表达分析,初步判断PD-L1与BRAF、KRAS、WT等结直肠癌之间的关系,是否具有显著差异。并在机制的探究中,我们利用该数据库,筛查PD-L1影响BRAF表达的信号分子,如c-JUN与YAP。同时,我们利用survminer数据库的生存率分析,并选取不同的cut-off值,观察PD-L1与PD-1基因是否会影响人类结直肠癌病人的生存曲线。

2. 利用Western Blot与RT-PCR技术,分析PD-L1的在人类结直肠癌细胞的表达水平,以及调控基因的表达情况。并利用MEK抑制剂药物对上游信号通路进行抑制,观察PD-L1的表达。同时,应用si RNA转染技术,通过降低YAP与c-JUN的表达,影响PD-L1的表达。

3.通过CRISPR-Cas9技术构建PD-L1敲除结直肠癌细胞。应用抗PD-L1抗体、cobimetinib、奥沙利铂或伊立替康分别对结直肠癌细胞进行治疗,治疗时间为1-2天,证明其是否会影响DNA双螺旋链断裂(p H2AX)以及活化的caspase-3,并从转录与蛋白相互作用上探究其耐药机制。

4.应用SCID鼠体内模型,验证PD-L1敲除的MC38细胞对奥沙利铂或伊立替康是否会影响其耐药性。结果1.我们通过TCGA数据库对RNA测序数据进行分析,发现PD-L1的m RNA在BRAFV600E突变肿瘤要比非BRAFV600E型中表达水平高。PD-L1的高表达水平与结直肠癌病人生存率较高有关,而PD-1的表达水平与结直肠癌病人生存率无关。该结论可能说明应用抗PD-L1抗体治疗结直肠癌的意义。

参考文献

[1]Update of humanized animal disease models in studying Graft-versus-host disease.Huang;;Cao;;Zheng.Human Vaccines&Immunotherapeutics,2018

[2]Immunotherapy-based combinations:an update.Giovanni Fucà;;Filippo de Braud;;Massimo Di Nicola.Current Opinion in Oncology,2018

[3]Over-activated PD-1/PD-L1 axis facilitates the chemoresistance of diffuselarge B-cell lymphoma cells to the CHOP regimen.Juan Liu;;Lina Quan;;Chunhui Zhang;;Aichun Liu;;Dongxia Tong;;Jinghua Wang.Oncology Letters,2018

[4]Targeting CDK1 and MEK/ERK Overcomes Apoptotic Resistance in BRAF-Mutant Human Colorectal Cancer.Peng Zhang;;Hisato Kawakami;;Weizhen Liu;;Xiangyu Zeng;;Klaus Strebhardt;;Kaixiong Tao;;Shengbing Huang;;Frank A.Sinicrope.Molecular Cancer Research,2018

[5]冯道夫.PD-L1对抗肿瘤药物介导的结肠癌细胞凋亡的影响[D].天津医科大学,2019.