人肝永生化细胞的应用

背景^[1-3]

人肝永生化细胞是正常肝细胞用SV40大T抗原转染得到。将含有SV40 T抗原的Bgl I-Hpa I片段的逆转录病毒载体导入兼嗜性包装细胞株PA317中生产病毒。THLE-2 and THLE-3表达正常成人肝上皮细胞特征性的表型。当注射到无胸腺裸鼠中时，它们不成瘤，具有接近二倍体的核型，不表达甲胎蛋白。

人肝永生化细胞

人肝永生化细胞细胞培养步骤：

一．培养基及培养冻存条件准备：

1、准备RPMI-1640培养基，90%；优质胎牛血清，10%。

2、人肝永生化细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3、人肝永生化细胞冻存液：90%完全培养基，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

二、人肝永生化细胞处理：

1、复苏人肝永生化细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2、人肝永生化细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

人肝永生化细胞传代可参考以下方法：

1)弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2)加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3)按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4)将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3、人肝永生化细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%DMSO后进行冻存。悬浮细胞冻存时，应将细胞收集，1000RPM条件下离心4分钟，少量保存上清液（防止细胞吸走），加入部分新鲜培养基，加入到冻存管中，在冻存管中加入10%DMSO后进行冻存。

应用^[4][5]

人肝永生化细胞可以用于永生化成人肝细胞的构建及生物学特性初步研究

通过将hTERT基因导入成人肝细胞HL-7702,构建了永生化成人肝细胞系(pLN/HL-7702),并且对导入hTERT基因前后两种细胞的形态、增殖状况、生物学功能进行了比较和研究,对新建永生化成人肝细胞系(pLN/HL-7702)致瘤性问题进行了初步研究,以期为进一步研究解决生物人工肝细胞来源问题奠定试验基础。

研究将携带有hTERT基因的逆转录病毒载体导入成人肝细胞HL-7702,通过RT-PCR,western-blot,和IEA(间接免疫荧光法)在基因和蛋白水平对所建细胞系(pLN/HL-7702)进行了鉴定;在倒置相差显微镜和透射电镜下观察并比较了基因导入前后细胞的形态及超微结构;采用MTT染色法检测在基因导入前后肝细胞的增殖能力变化,连续观察并描绘生长曲线;采用RT-PCR法检测基因导入前后肝细胞功能基因表达情况;采用western-blot检测基因导入前后肝细胞细胞色素P450的表达;并通过软琼脂实验、裸鼠致瘤性实验对所建细胞系pLN/HL-7702的致瘤性进行了初步分析。

结果:1.RT-PCR、western-bolt和IEA可检测到hTERT基因在肝细胞内转录和表达,可检测到相关蛋白;

2. 光镜和电镜观察细胞形态和超微结构未发现基因导入前后肝细胞的差异;

3. 细胞增殖实验表明细胞在导入基因后增殖能力有了明显的提高;

4. 肝细胞功能基因的转录在转染前后均可检测到;

5. 基因导入前后细胞上清的检测表明肝细胞的一般生化功能未受影响;

6. 基因导入前后肝细胞通过western-bolt均可检测到细胞色素P450的表达;

7. 软琼脂实验、裸鼠致瘤性实验未提示pLN/HL-7702有致瘤性表现。

讨论:本研究成功建立永生化成人肝细胞系pLN/HL-7702,其体外增殖能力较原细胞系HL-7702明显提高,在形态、结构及生物学功能方面与基因导入前无明显差异,并可检测到细胞色素P450的表达,初步致瘤性分析未发现细胞有致瘤性,提示该细胞系进一步研究后有可能为生物人工肝的治疗提供一种安全有效的肝细胞来源。

参考文献

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[5]王开利.永生化成人肝细胞的构建及生物学特性初步研究[D].中国人民解放军军医进修学院,2009.