SCABER人鳞状膀胱癌贴壁细胞系的应用

背景^[1-3]

SCABER人鳞状膀胱癌贴壁细胞系源于一位58岁患有膀胱鳞癌的白人男性患者，含有不常见的G6PDA型同工酶。

SCABER人鳞状膀胱癌贴壁细胞系

SCABER人鳞状膀胱癌贴壁细胞系培养步骤：

复苏SCABER人鳞状膀胱癌贴壁细胞系细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

SCABER人鳞状膀胱癌贴壁细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a）、对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

SCABER人鳞状膀胱癌贴壁细胞系细胞冻存：（注：无血清冻存液冻存细胞的方法请参考我司官网货号：C7001）

1、细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃25cm2培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；

2、添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入完全培养液终止消化，轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min；

3、用适量的冻存液重悬细胞，并放置于冻存管中；

4、先将细胞冻存管放置于-20℃1.5h，然后将其移入-80℃

应用^[4][5]

SCABER人鳞状膀胱癌贴壁细胞系可以用于肺癌组织中HMGN5基因的表达及其在肺癌发病中作用机制的研究

探讨肺癌组织中HMGN5基因的表达水平、HMGN5与临床病理特征的相关性；构建HMGN5的shRNA重组慢病毒载体；RNA干扰技术沉默HMGN5基因对肺癌A549、H1299细胞增殖和细胞周期的影响；应用RNAi技术沉默肺癌细胞A549和H1299中的HMGN5基因,抑制HMGN5基因对裸鼠成瘤能力的影响,为肺癌的基因靶向提供理论依据。

方法：用Real-time PCR的方法检测肺癌组织内、癌旁组织中HMGN5 mRNA的表达情况,分析HMGN5表达与肺癌临床病理特征的相关性；设计靶向HMGN5基因siRNA干扰序列；将设计的序列进行合成载体构建；挑选阳性、测序正确的质粒进行病毒包装；包装的病毒感染人肺癌细胞A549、H1299,应用Real-time PCR和VVestern blot的方法验证人肺癌细胞A549、H1299的沉默效率；应用RNAi技术抑制HMGN5基因在肺癌A549、H1299细胞中的表达,HMGN5 siRNA重组慢病毒感染人肺癌细胞,应用MTT方法检测HMGN5沉默表达后人肺癌细胞增殖能力的变化；

应用Brdu的方法检测沉默IMGN5表达,人肺癌细胞DNA合成速度变化；应用克隆形成实验验证HMGN5沉默后人肺癌细胞的克隆形成能力的改变；采用流式细胞仪检测细胞周期的变化,以探讨HMGN5在肺癌细胞中的生物学功能；建立人肺癌A549细胞裸鼠皮下种植瘤模型,通过观察肿瘤的大小并对瘤体进行称重,观察HMGN5基因沉默对裸鼠的体内成瘤能力的影响。

结果：Real-time PCR结果显示在肺癌组织中的表达水平(4.60±0.47)显著高于癌旁组织(1.02±0.55)(P<0.05)；HMGN5 siRNA重组慢病毒载体构建成功；Real-time PCR和Western blot结果显示,实验设计的siRNA靶点序列在人肺癌细胞A549和H1299细胞内沉默表达HMGN5的沉默效率达到80%：重组的HMGN5 siRNA慢病毒载体作用于人肺癌细胞A549、H1299细胞后,HMGN5基因的mRNA及蛋白表达水平明显降低,MTT、Brud、细胞克隆形成实验结果表明转染HMGN5-siRNA的A549、H1299细胞增殖能力、DNA复制能力、克隆形成能力明显降低,流式细胞术实验结果表明转染HMGN5-siRNA的A549、H1299细胞阻滞于Go/G1期,使细胞分裂减缓；成功建立A549裸鼠皮下移植瘤模型,体内观察实验结果表明注射HMGN5-siRNA小鼠的转移瘤质量及体积较对照组明显降低,裸鼠体内成瘤能力明显受到抑制。

参考文献

[1]HMGN5/NSBP1:A new member of the HMGN protein family that affects chromatin structure and function.Mark Rochman;;Cedric Malicet;;Michael Bustin.BBA-Gene Regulatory Mechanisms,2009

[2]The Interaction of NSBP1/HMGN5 with Nucleosomes in Euchromatin Counteracts Linker Histone-Mediated Chromatin Compaction and Modulates Transcription.Mark Rochman;;Yuri Postnikov;;Sarah Correll;;Cedric Malicet;;Stephen Wincovitch;;Tatiana S.Karpova;;James G.McNally;;Xiaolin Wu;;Nina A.Bubunenko;;Sergei Grigoryev;;Michael Bustin.Molecular Cell,2009

[3]Intrinsic Protein Disorder and Interaction Promiscuity Are Widely Associated with Dosage Sensitivity.Tanya Vavouri;;Jennifer I.Semple;;Rosa Garcia-Verdugo;;Ben Lehner.Cell,2009

[4]The Interaction of HMGB1 and Linker Histones Occurs Through their Acidic and Basic Tails.Laura Cato;;Katherine Stott;;Matthew Watson;;Jean O.Thomas.Journal of Molecular Biology,2008

[5]陈鹏.肺癌组织中HMGN5基因的表达及其在肺癌发病中作用机制的研究[D].吉林大学,2011.