SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒的应用

背景^[1-3]

SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒采用上层胶和下层胶的预混配方，只需加入10%APS即可凝胶，简便快捷。下层胶与上层胶可连续灌注，时间节省一半以上。所配的上层胶可以带有红色，使得电泳孔清晰易辩利于上样，该指示剂电泳结束时跑在最前端，既能监控电泳过程，也能在转印过程转移到膜上，监测转移效率。本试剂盒灌制的凝胶也可用于非变性PAGE凝胶电泳。本产品配套提供改良型促凝剂，其具有更好的稳定性和催化效能，配胶过程中无需额外添加TEMED。

SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒

SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒使用说明：

以下按制备一块0.75mm|1.00mm|1.5mm的mini胶为例，多块胶按比例放大体积，也可以多配一些备用。

1.取等体积的Separating Gel Buffer(2×)与Separating Gel Solution(2×)各2ml|2.8ml|4ml于合适的容器中，混匀。

2.取1ml|1.5ml|2ml 5%Stacking Gel Solution于合适的容器中。

注意：如果需要，可以加入2μl|3μl|4μl染料，混匀。此染料能让上样孔易辩，电泳时会跑在最前沿，监测电泳过程，电转时也能转印到膜上，监测电转效果。在15%胶浓度时，此染料迁移速率比溴酚蓝慢。

3.向步骤1的分离胶混合液中加入40μl|60μl|80μl 10%APS Solution，混匀。

4.用1ml移液器迅速将上述分离胶灌入制胶槽中，直到合适的液面高度为止。（液面距短玻板边沿约1.5cm）

5.向步骤2的浓缩胶混合液中加入10μl|15μl|20μl 10%APS Solution，混匀。

6.用1ml移液器立即（分离胶未凝固）将上述浓缩胶沿着玻板缓慢加入制胶槽中，灌满为止，插入梳子，室温聚合15-30min.凝固后，即可拔去梳子，加样进行电泳。

注意：为了使分离胶与浓缩胶分层效果更好，灌浓缩胶时，用1ml的移液器边灌胶，边从玻板的一端慢慢地移动到另一端。也可在插入梳子后，轻轻地稍微抬起浓缩胶液面较浅的一端，再缓慢放下，以帮助浓缩胶平衡，从而使得界面平整。一般情况下无需操作，界面都很平整。

应用^[4][5]

SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒可以用于基于包涵体的重组抗菌肽表达研究

研究以Metchnikowin(Metch)和MagininⅡ(MagⅡ)作为目的抗菌肽,选取易于形成包涵体的绿色荧光蛋白(GFP)、棕榈酰磷脂转移酶(PagP)和组蛋白折叠结构域(TAF)作为融合标签,构建系列融合蛋白(融合标签与抗菌多肽之间依次插入Ni2+切割的识别位点、His6-tag纯化标签及蛋白酶TEV识别位点)(融合标签-NHT-AMPs)及相应的表达载体。

利用大肠杆菌表达获取包涵体,经过SDS-PAGE、灰度分析和Western Blot检测,三种融合标签相比,PagP有利于获得较高的抗菌肽表达量,其与抗菌肽融合表达的条件为表达时间10 h、诱导物IPTG浓度为0.5 mM。

将包涵体溶解于6 M盐酸胍的Hepes buffer(pH8.2)中,进行融合蛋白的Ni2+化学裂解。为进一步研究Ni2+化学裂解的条件,本研究探索了反应时间、温度和融合蛋白浓度三个因素对Ni2+化学裂解效率的影响,结果显示在60℃、融合蛋白为200μM的条件下反应24 h,Ni2+可有效裂解融合蛋白,形成融合标签PagP与短肽HT-AMPs。化学裂解后的融合标签可通过相应的缓冲液进行稀释沉淀,而短肽HT-AMPs经Ni-NTA得到进一步纯化,纯化后的短肽HT-AMPs经TEV蛋白酶酶切后得到完整的抗菌肽。

本研究还对抗菌肽的活性进行了测定,抑菌实验显示,HT-MagⅡ(HT-Metch)经TEV酶切后不具有生物学活性,可能由于咪唑、高浓度盐的影响,除盐后均表现出抑菌活性,MagⅡ能杀死大肠杆菌MG 1655和金黄色葡萄球菌,表现出对革兰氏阳性菌与阴性菌的双向抗性;Metch能杀死枯草芽孢杆菌和藤黄微球菌表现出革兰氏阳性菌抗性。

参考文献

[1]Antimicrobial peptides.Ling-juan Zhang;;Richard L.Gallo.Current Biology,2016

[2]Combining a PagP fusion protein system with nickel ion-catalyzed cleavage to produce intrinsically disordered proteins in E.coli.Somaya Zahran;;Jonathan S.Pan;;Philip B.Liu;;Peter M.Hwang.Protein Expression and Purification,2015

[3]Targeted expression,purification,and cleavage of fusion proteins from inclusion bodies in Escherichia coli.Peter M.Hwang;;Jonathan S.Pan;;Brian D.Sykes.FEBS Letters,2014

[4]A PagP fusion protein system for the expression of intrinsically disordered proteins in Escherichia coli.Peter M.Hwang;;Jonathan S.Pan;;Brian D.Sykes.Protein Expression and Purification,2012

[5]陈长超.基于包涵体的重组抗菌肽表达研究[D].华南农业大学,2016.