HKC 人胚肾小管上皮细胞系的应用

背景^[1-3]

HKC人胚肾小管上皮细胞系常用于肾小管上皮细胞代谢方面的研究。STR检测发现该细胞被人肾皮质近曲小管上皮细胞HK-2污染。

HKC人胚肾小管上皮细胞系

HKC人胚肾小管上皮细胞系培养操作：

1）复苏HKC人胚肾小管上皮细胞系细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）HKC人胚肾小管上皮细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）HKC人胚肾小管上皮细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；

1.细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

HKC人胚肾小管上皮细胞系可以用于阿托伐他汀抑制无血清和缺氧条件下对比剂诱导的人肾小管上皮细胞凋亡

探讨阿托伐他汀在无血清和缺氧条件下对比剂诱导人肾小管上皮细胞凋亡中的作用及机制。

[方法]培养的人肾小管上皮细胞(HKC)在无血清和缺氧条件下分别与不同浓度(10、20、40、80、120、150mgI/ml)的碘海醇(非离子型低渗对比剂)共孵育2h；碘海醇(120mgI/ml)无血清和缺氧条件下干预HKC细胞0、1、2、4、8、12h。不同浓度阿托伐他汀(10-8、10-7、10-6、10-5mol/L)先与HKC细胞共孵育12h后，碘海醇(120mgI/ml)无血清和缺氧条件下刺激2h和12h。CCK-8法检测细胞增殖；流式AnnexinV-FITC/PI双染检测细胞凋亡；荧光显微镜检测细胞内ROS水平；Western-Blot检测Bax、Bcl-2蛋白。

[结果]在无血清和缺氧条件下碘海醇呈一定的浓度和时间依赖性诱导HKC细胞活性下降和凋亡。

与正常情况下碘海醇干预细胞相比，无血清缺氧培养加重碘海醇对细胞的损伤，表现为细胞活性受到抑制增强(0.474±0.060VS0.312±0.076，P<0.05，n=3)，凋亡明显增加(9.53%±1.19%VS18.83%±1.36%，P<0.05，n=3)，细胞内ROS产生增多，Bax蛋白上调增加(1.276±0.058VS1.468±0.076，P<0.05，n=4)，Bcl-2蛋白表达下调增加(0.117±0.022VS0.067±0.009，P<0.05，n=4)。

阿托伐他汀在10-810-6mol/L范围内呈浓度依赖性抑制无血清和缺氧条件下碘海醇诱导的HKC细胞活性下降、凋亡、细胞内ROS的产生、Bax蛋白表达上调及Bcl-2蛋白表达下调。细胞内ROS水平与Bax蛋白表达呈正相关，与Bcl-2蛋白表达呈负相关。

[结论]无血清和缺氧条件下碘海醇呈浓度和时间依赖性诱导HKC细胞活性下降、凋亡，此作用与细胞内氧化应激及Bax蛋白表达上调、Bcl-2蛋白表达下调相关。阿托伐他汀在10-810-6mol/L范围内呈浓度依赖性抑制无血清和缺氧条件下碘海醇诱导的HKC细胞凋亡。

参考文献

[1]Short-Term,High-Dose Atorvastatin Pretreatment to Prevent Contrast-Induced Nephropathy in Patients With Acute Coronary Syndromes Undergoing Percutaneous Coronary Intervention(from the ARMYDA-CIN[Atorvastatin for Reduction of MYocardial Damage during Angioplasty–Contrast-Induced Nephropathy]Trial.Giuseppe Patti;;Elisabetta Ricottini;;Annunziata Nusca;;Giuseppe Colonna;;Vincenzo Pasceri;;Andrea D'Ambrosio;;Antonio Montinaro;;Germano Di Sciascio.The American Journal of Cardiology,2011

[2]Usefulness of Atorvastatin(80 mg)in Prevention of Contrast-Induced Nephropathy in Patients With Chronic Renal Disease.Anna Toso;;Mauro Maioli;;Mario Leoncini;;Michela Gallopin;;Delio Tedeschi;;Carlo Micheletti;;Concetta Manzone;;Marcello Amato;;Francesco Bellandi.The American Journal of Cardiology,2010

[3]Cystatin C and Contrast-Induced Acute Kidney Injury.Carlo Briguori;;Gabriella Visconti;;Natalia V.Rivera;;Amelia Focaccio;;Bruno Golia;;Rosalia Giannone;;Diletta Castaldo;;Francesca De Micco;;Bruno Ricciardelli;;Antonio Colombo.Circulation,2010

[4]N-Acetylcysteine Amide Protects Renal Proximal Tubular Epithelial Cells against Iohexol-Induced Apoptosis by Blocking p38 MAPK and iNOS Signaling.Gong,Xuezhong;Celsi,Gianni;Carlsson,Katarina;Norgren,Svante;Chen,Ming.American Journal of Nephrology,2010

[5]陈秀平.阿托伐他汀抑制无血清和缺氧条件下对比剂诱导的人肾小管上皮细胞凋亡[D].福建医科大学,2012.