人胚肺成纤维细胞的应用

背景^[1-3]

人胚肺成纤维细胞是人胚肺组织采用胰蛋白酶-胶原酶混合消化法结合差速贴壁法制备而来。人胚肺成纤维细胞核型正常，该细胞为有限细胞系，传至第七代时建立起的细胞系，正常情况下细胞可以稳定的传代至46代左右。

人胚肺成纤维细胞

人胚肺成纤维细胞培养基及培养冻存条件准备：

1）准备F12K（推荐iCell-0007）培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2）人胚肺成纤维细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

3）人胚肺成纤维细胞冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

人胚肺成纤维细胞处理：

1）冻存细胞的复苏：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2）人胚肺成纤维细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。

3.轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3）人胚肺成纤维细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

下面T25瓶为例；

1.细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×10^6~1×107个活细胞/ml.

2.1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞，按每1ml冻存液含1×10^6~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

3.将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。

应用^[4][5]

人胚肺成纤维细胞可以用于EGF诱导人胚肺成纤维细胞衰老的机制研究

研究发现EGF能够诱导人胚肺成纤维细胞IMR90发生衰老,所以本课题主要对EGF诱导IMR90细胞衰老的机制进行了探究。

研究方法与结果:在本研究中,我们发现EGF能够诱导IMR90细胞发生衰老。首先,细胞生长曲线和Brd U掺入实验证明了EGF处理抑制了IMR90细胞的生长。通过观察,发现经EGF处理的细胞呈现出衰老细胞的表征,SA-β-gal染色和DAPI染色的结果表明EGF诱导IMR90细胞发生了衰老。在此基础上,免疫荧光和免疫印迹技术的检测结果显示,53BP1凝集点形成,γH2A.X和53BP1蛋白水平上调,表明EGF处理引发了DNA损伤反应;p38、p-p38、p53、p-p53、p21和p16蛋白水平上调,表明EGF激活了衰老相关信号通路。

在探究EGF诱导IMR90细胞衰老的机制的过程中,Ras-GTP assay和免疫印迹的结果表明EGF刺激之后,细胞内的Ras-GTP、p-ERK1/2蛋白水平上调,EGF激活了细胞内的Ras信号通路;利用慢病毒敲减BRaf抑制了EGF引起的细胞衰老。因此,推测EGF是通过激活Ras-Raf-MEK-ERK通路诱导IMR90细胞发生衰老的。此外,我们还发现EGF诱导IMR90细胞衰老与细胞周期相关,处于G2/M期的细胞更容易被EGF诱导发生衰老。

研究结论与意义:综合以上研究内容,我们发现EGF通过激活EGFR下游的Ras信号通路,引起细胞内DNA损伤反应和衰老相关信号通路的激活,导致IMR90细胞的衰老。这些研究成果丰富了人们对EGF生物学功能的认知,有助于推动EGF诱导细胞衰老的机制的研究。

参考文献

[1]The Epidermal Growth Factor Receptor:Structure-Function Informing the Design of Anticancer Therapeutics.Ruth A Mitchell;;Rodney B Luwor;;Antony W Burgess.Experimental Cell Research,2018

[2]Senescence and Cancer.Sulin Zeng;;Wen Shen;;Li Liu.Cancer Translational Medicine,2018

[3]MEK inhibitors in oncology:a patent review(2015-Present).Mahapatra;;Asati;;Bharti.Expert Opinion on Therapeutic Patents,2017

[4]Baicalein increases cisplatin sensitivity of A549 lung adenocarcinoma cells via PI3K/Akt/NF-κB pathway.Meiling Yu;;Benquan Qi;;Wu Xiaoxiang;;Jian Xu;;Xiaolin Liu.Biomedicine&Pharmacotherapy,2017

[5]沈明香.EGF诱导人胚肺成纤维细胞衰老的机制研究[D].江苏大学,2019.